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近年来,环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)对人类和野生动物健康的不良影响已引起学术界和政府的广泛关注。EDCs是能干扰内分泌系统从而影响生物生殖的一大类化合物。17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol,EE2)是一种常见的EDCs,它是合成避孕药的一种常用成分,通过污水处理系统进入水环境。在污水处理系统排出的水中,EE2的浓度可达7.2-42ng/L。约5.7％的美国河流中EE2含量超过5ng/l。由于EE2的半衰期长及生物富集作用,鱼体内EE2的含量可比自然环境中高332倍,而且EE2的雌激素作用在生物体内为雌二醇(E2)和雌激素酮(E1)的10-50倍。鱼类暴露于EE2污染的水环境中可引起卵黄生成素(Vitellogenin,Vtg)表达,性分化异常及生殖功能受损。鉴于EE2的强效作用以及在环境中的广泛分布,EE2可导致鱼类不育甚至影响鱼类的种群繁殖。
为了解EE2暴露对斑马鱼生长发育以及生殖系统的影响,我们将斑马鱼分成溶剂对照、0.4ng/L、2ng/L和10ng/LEE2处理组,从出生后2天(2 dayspost hatch,2dph)暴露至90dph,之后将所有斑马鱼在不含EE2的清水中恢复至180dph。90dph时,2ng/L和10ng/LEE2处理组斑马鱼的死亡率及心包水肿率均显著高于对照组,10ng/LEE2组的平均体重和体长亦显著低于对照组。这些结果显示高于10ng/L的EE2暴露会有较强的非特异毒性作用。我们也利用逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcdption Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测了暴露于EE2的斑马鱼出生后第2天至出生后28天Vtg基因的mRNA表达水平。结果显示10ng/LEE2暴露21天后(21 day post hactch,21 dph)便可诱导Vtg表达。用我们实验室构建的对雌激素敏感的Vtg-EGFP转基因斑马鱼做相同的暴露处理进一步验证了RT-PCR的结果,表明。Vtg可作为检测环境雌激素(Environmental estrogens,Ees)污染水环境的早期敏感的生物标志物。
在EE2暴露影响斑马鱼生殖功能的机理研究中,EE2干扰斑马鱼性腺发育分化从而损害生殖功能是一个重要的原因。90dph时的性腺组织切片显示EE2暴露严重抑制处理组斑马鱼的正常性腺发育和分化,这些鱼的性腺处于幼稚卵巢甚至完全未分化阶段。将这批斑马鱼在清水中恢复试验3个月后,再次行性腺组织切片检查。结果提示各组斑马鱼已恢复正常性别比例,然而EE2处理组雄性斑马鱼的精巢明显异常,表现为生精小管严重畸形和精子数量减少。雌鱼卵巢组织切片未发现明显异常。
180aph时的交配产卵实验显示EE2处理组斑马鱼的产卵数量及12hpf卵存活率均较对照组显著降低。为了研究EE2对雌雄斑马鱼分别的生殖毒理作用,我们又采用了雌/雄置换交配的方法,分别研究了EE2处理组雌雄两性的生殖功能。结果显示EE2处理组雌雄鱼生殖功能均严重受损,表现为雌鱼产卵数量下降,卵存活率降低;进一步通过精子计数及精液分析,证实处理组卵存活率下降的原因是雄鱼的精液量下降所致。
一些EDCs如硫丹(endosulfan)和壬基酚(nonylphenol,NP)可干扰斑马鱼胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的迁移和分布从而可能对斑马鱼的生殖产生不利影响。目前尚没有关于Ees对斑马鱼PGC作用的报道。我们通过用绿色荧光蛋白标记PGC以及整体原位杂交,研究了EE2暴露对斑马鱼胚胎PGC的迁移和分布的影响。结果显示,10ng/L和100ng/LEE2处理组斑马鱼PGC的迁移和分布与对照组无显著差异。分析其原因可能和早期性腺组织对EE2不敏感有关。我们仍不能排除其他的Ees对PGC可能的不利影响。