新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一种自然界中普遍存在的具有荚膜的酵母型病原真菌,可经呼吸进入人体,引起隐球菌性的肺炎和脑膜炎,并导致每年大约60万人死亡。新生隐球菌主要感染免疫力缺陷的人群,由于艾滋病的大量传播、肿瘤及化疗药物的使用、移植术后免疫抑制药物的使用等原因,新生隐球菌病的发病率逐年升高,在国外已成为艾滋病患者常见的并发症之一,并常导致病患死亡。我国新生隐球菌的发病率也呈上升的趋势并展现了独特的感染免疫健全人群的倾向性。针对隐球菌病的治疗,目前临床上使用的真菌抗生素疗效往往不佳,即便是联合用药,治疗总有效率也不足75%,这使得我国的新生隐球菌防控面临着严峻的考验。蛋白质水解是高度特异并由一系列背景各异的蛋白酶参与的过程。真核细胞中主要有两种蛋白水解途径:即泛素蛋白酶体系统和溶酶体介导的蛋白质水解(如自噬)。自噬(autophagy)是真核生物中一种进化高度保守的蛋白质降解过程。在此过程中,由双层膜组成的自噬泡将细胞中损坏的蛋白或细胞器等物质包裹后,运送到溶酶体或液泡中降解,使得大分子物质被降解后重新为细胞所利用。自噬在维持细胞稳态,调节细胞分化和发育以及决定细胞寿命等方面起着重要作用。自噬蛋白降解与泛素化蛋白降解存在一定程度的相似性,如自噬相关蛋白Atg8和Atg12在自噬通路中就起着类似泛素的作用,故称之为类泛素蛋白。本研究以自噬蛋白降解通路中的类泛素蛋白Atg8、Atg12及其互作蛋白Atg5为研究对象,通过基因敲除、互补及超表达,荧光标记,表性分析等手段对其在新生隐球菌形态发育及致病性中的作用进行了分析,主要结果如下:首先我们利用酿酒酵母Atg5、Atg8和Atg12序列,通过同源性序列比对鉴定了新生隐球菌自噬相关蛋白Atg5、Atg8和Atg12。利用体外同源重组技术,我们构建了自噬相关蛋白-绿色荧光蛋白融合表达载体Atg5-EGFP、Atg8-EGFP和Atg12-EGFP,经基因枪转化野生型菌株H99和抗性筛选后,分别获得了 Atg5-EGFP、Atg8-EGFP和Atg12-EGFP融合蛋白表达的绿色荧光菌株。对其进行亚细胞定位分析,发现这三个自噬蛋白在细胞中的定位与模式生物酿酒酵母基本一致。其次我们构建了自噬相关基因ATG5、ATG8和ATG12敲除载体,利用基因枪转化技术和体内同源重组原理分别对ATG5、ATG8和ATG12进行了基因敲除并获得了基因敲除突变体Aatg5,△ △atg8和Aatg12。同时我们构建了基因互补载体,经转化筛选后得到了相应基因互补菌株。对上述菌株在应激条件下的表型进行探究,发现在高温(37℃)、高渗透压(NaCl/KCl)、氧化压力(H202)、高去污活性(SDS)等应激条件以及黑色素产生等方面,Aatg5、Aatg8和Aatg12菌株与野生型菌株相比并未表现出差异。在氮饥饿诱导实验中,生长至对数生长期的细胞在蛋白酶抑制剂PMSF的存在下,在SD-N培养基中饥饿诱导培养4 h以上。显微镜下观察发现,野生型菌株的液泡中有,大量自繼泡泡的聚集,而Aatg5、△atg8和△atg12突变体菌株均不形成自噬泡,表明上述突变体自噬过程受到阻断。随后对突变体菌株饥饿后的生存率进行了探究,分别将野生型、突变体以及基因互补菌株分别以2×107个/ml细胞浓度接种于 SD-N培养基中,取氮饥饿诱导培养0h,24 h,48 h,721h,96 h后的菌液铺于SDA培养基上,培养48 h后统计平板上的CFU并绘制生存曲线,结果发现突变体菌株表现出饥饿敏感且不易生存的特点。新生隐球菌属于担子菌,有α和a两种交配型,在MS培养基诱导下能够交配并产生担孢子。本研究通过交配的方式在原有α交配型突变体的基础上获得了 a交配型突变体菌株,并通过交配实验检测了 △ag5、△atg8和△atg12突变体菌株交配能力变化,结果发现不同交配型的Aatg5、△atg8和Aatg12突变体在MS培养基上可交配形成双核菌丝,但不能产生担孢子,表明突变体菌株有性生殖过程被阻断。为进一步探究突变体菌株交配不产孢的机理,本研究选取了核定位基因N基P 并构建了原位互补载体Nop1-GFP、Nop1-mCherry载体,通过基因枪转化方式将其分别转化到a和a两种交配型的野生型H99、KN99a以及突变菌株Aatg5、△atg8和△atg12中,经筛选后得到核定位荧光标记菌株。相应菌株在黑暗,25℃条件下诱导交配14天后通过共聚焦荧光显微镜对其菌丝细胞核定位进行观察,结果发现野生型菌株担子内的两个细胞核能正常融合进行减数分裂并产生担孢子,而△atg5、△atg8和△atg1突变体菌株担子的细胞核可以融合,但无法进行减数分裂过程,从而导致突变体菌株无法产生担孢子。最后本研究利用小鼠滴鼻感染模型对Aatg5、△att8和△atg12突变体菌株进行致病性检测。选取8周龄大的C57BL6小鼠,每只小鼠接种105个酵母细胞,每个菌株接种10只小鼠。接种2周后采取每天称重记录的方式观察小鼠生存状态,对濒死或出现疼痛的小鼠进行吸入CO2处死并解剖,使用具有PRISM版本7.0的1ogrank程序分析小鼠实验的生存率数据。为了与H99感染小鼠的真菌耐受量相比较,在处死时间点,取Aatg突变菌株接种小鼠肺,脑和脾脏,用10%福尔马林溶液固定,并送到公司做切片处理。另外将分离的肺,脑和脾在PBS缓冲液中用匀浆器匀浆,稀释再悬浮液,并将100 μL各稀释液涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素的YPD培养基上,在30℃温育2天后测定菌落数。结果发现与野生型菌株相比,Aatg5突变体致病性略降低,△atg8和△atg12突变体致病性则显著降低。综上所述,本研究对新生隐球菌自噬相关基因ATG5、ATG8和ATG12进行了鉴定与分析,研究其在亚细胞结构中的定位变化;通过基因枪转化方式获得上述基因敲除突变体△atg5、Aatg8和△atg12,并对突变体菌株进行应激条件表型进行分析;上述突变体菌株自噬过程被阻断,对氮饥饿诱导敏感且存活能力降低;突变体菌株交配后不能产生担孢子,进一步分析发现其可能原因是突变体交配后其担子内的细胞核融合后不能进行减数分裂。小鼠致病性分析结果表明,自噬基因敲除突变体菌株Aatg5、△atg8和Aaag12的致病性均有不同程度的降低,其中Aatg5菌株致病性略有降低,而Aaatg8和Aatg12菌株的致病性显著降低。