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【背景】牙周炎是一种以牙周附着丧失,牙槽骨吸收为特点的口腔疾病。其发病率高,是导致成年人失牙的最主要原因。对于牙周炎,目前无论基础治疗还是手术治疗对于已缺损组织的修复效果都仍不理想,无法实现功能性的牙周组织再生。这可能与牙周炎发病机制复杂、细菌无法彻底清除以及机体的免疫反应特质对疾病发生发展的影响等密切相关。随着组织工程医学的蓬勃发展,人们开始尝试应用组织工程的方法修复牙周缺损。种子细胞是影响修复效果的一个重要因素。牙周膜干细胞(periodontal ligamentstem cells, PDLSCs)是一种非常有潜力,可以应用于牙周组织再生的细胞。其来源于牙周局部,并且体内移植后可以形成牙骨质-牙周膜样的结构。该结构是功能性牙周再生的重要标志。口腔是有菌环境,牙周病患者又常常伴随着易于引起菌斑聚集的各种因素。细菌或其毒性产物的存在可能影响细胞治疗的效果。机体识别细菌等微生物及其毒性产物主要依靠Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)。TLRs是一类保守的受体家族,目前在人类已经发现10种(TLR1-10)TLRs亚型,不同亚型的受体识别不同结构的配体。牙周炎的致病菌主要为革兰氏阴性菌,革兰氏阴性菌的主要致病成分为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),也被称作内毒素,是主要由TLR4识别的。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)可以表达TLRs,并且TLRs激活后能够影响MSCs的功能。不同来源的MSCs对于TLRs的表达不同,TLRs激活后其生物学特性的改变也不相同。PDLSCs属于MSCs的一种。关于PDLSCs上TLRs的表达情况及其激活后对于PDLSCs生物学特性的影响仍未见报道。另外骨髓MSCs(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs),作为最具有代表性的系统性MSCs,对其TLRs的表达及其对细胞功能的影响各报道也不尽相同。【目的】探明PDLSCs及BMMSCs上TLRs的表达情况。重点研究TLR4激活后对于两种细胞生物学特性的影响。尤其关注两种细胞成骨能力的变化。试图阐明引起该变化的相关信号通路,为临床上能更好的应用两种细胞,趋利避害,提供理论依据。同时也为牙周炎发病机制的研究提供相关线索。【方法】1)体外分离培养PDLSCs及BMMSCs,鉴定两种细胞的表面标志;real-time PCR检测两种细胞mRNA水平TLR1-TLR10的表达。Western Blot检测蛋白水平TLR4的表达。应用LPS刺激两种细胞,检测NF-κB通路的变化。2)应用LPS体外刺激两种细胞,cck-8法检测其增殖能力变化;划痕试验检测其迁移能力变化;成骨成脂诱导后,real-time PCR检测两种细胞关键性成骨(ALP,Runx2和SP7)及成脂(LPL,PPARγ)基因变化;辅助以ALP染色检测成骨诱导后ALP活性变化。茜素红、油红O染色及定量检测两种细胞最终分化能力改变;将两种细胞和激活后的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs)共培养,通过增殖试验和凋亡试验检测两种细胞免疫调节能力变化。3)在LPS刺激的同时,加入TLR4抗体,阻断TLR4作用,观察对于两种细胞成骨能力的影响。4)在加入LPS刺激,NF-κB通路被激活的情况下,加入NF-κB通路阻断剂PDTC (Ammoniumpyrrolidinedithiocarbamate),阻断NF-κB通路,观察对于两种细胞成骨能力的影响。5)检测LPS刺激下两种细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化;在LPS刺激的同时,加入Wnt/β-catenin通路的阻断剂DKK-1(Dickkopf1),观察其对于两种细胞成骨能力的影响。6)在SD大鼠口内利用LPS牙龈局部注射制造牙周炎模型,通过TLR4抗体或NF-κB通路阻断剂PDTC进行干预,MicroCT观察各组大鼠牙周骨缺损情况。对各组组织进行石蜡包埋,切片,ALP及Trap染色,利用软件定量分析染色结果,以研究阻断TLR4或NF-κB通路后对牙周炎发生发展的影响。【结果】1)体外分离培养的PDLSCs及BMMSCs阳性表达Stro-1,CD44,CD146,CD90,CD105,CD29;阴性表达CD31,CD45。在基因水平除TLR7外,两种细胞均不同程度的表达各种TLRs。在PDLSCs中TLR3表现出了较强的表达,而TLR4的表达量则要弱于BMMSCs中TLR4的表达;在蛋白水平两种细胞均表达TLR4;经过TLR4的配体LPS刺激后两种细胞的NF-κB通路均被激活。2)LPS刺激后两种细胞的增殖能力增强,迁移能力减弱;两种细胞的成脂相关基因表达增高,成脂能力增强;PDLSCs的ALP染色减弱,成骨相关基因表达降低,成骨能力减弱;BMMSCs的ALP染色虽然减弱, ALP基因表达明显降低,但SP7(又名Osterix)有增多趋势,最终茜素红定量显示成骨能力无明显改变。共培养试验中,LPS刺激两种MSCs后,PBMNC的增殖及凋亡均无明显改变。3)TLR4抗体阻断后,可以较大程度上逆转LPS刺激下的PDLSCs的成骨能力,而对LPS刺激下的BMMSCs的成骨能力无明显影响。4)NF-κB通路阻断后可以一定程度上逆转LPS刺激下的PDLSCs的成骨能力,对LPS刺激下的BMMSCs成骨能力无明显影响。5)LPS刺激下,两种细胞的Wnt/β-catenin通路都被明显激活。当加入Wnt/β-catenin通路阻断剂DKK-1后,LPS刺激下的PDLSCs的成骨能力得到了明显的逆转,而对LPS刺激下的BMMSCs成骨能力无明显影响。6)MicroCT结果显示LPS局部牙龈注射能够在大鼠口内造成明显的牙周缺损,LPS+anti-TLR4组和LPS+PDTC组的骨缺损程度明显减轻,差异具有统计学意义(P<0.05),ALP染色结果显示TLR4中和抗体或者PDTC能显著提高牙周膜组织的成骨能力,Trap染色显示各组的破骨细胞数量无明显差异。【结论】1) PDLSCs及BMMSCs都表达有活性的TLR4。PDLSCs和BMMSCs不同程度的表达各种TLRs亚型,其中TLR4的表达在蛋白水平得到了验证,并且LPS刺激可使NF-κB通路活化。2) TLR4激活后能够改变PDLSCs及BMMSCs的生物学特性。TLR4激活可以促进两者增殖,减弱两者迁移;对PDLSCs可减弱其成骨能力促进其成脂能力;对BMMSCs可促进其成脂而对其成骨影响不大;TLR4对两者的免疫调节能力都没有明显影响。3)抗体阻断TLR4后可以部分逆转LPS刺激下的PDLSCs成骨能力。细胞通过TLR4感受LPS激活,本试验进一步证明了这一点。但在成骨分化的长期过程中,抗体不能达到100%的阻断作用。4) TLR4激活后引起的NF-κB通路活化参与了LPS所引起的减弱PDLSCs成骨能力的过程。应用NF-κB阻断剂后可以部分的逆转PDLSCs的成骨能力。5) TLR4激活能够引起Wnt/β-catenin通路活化,后者参与了减弱PDLSCs成骨分化的过程。LPS刺激后Wnt/β-catenin通路明显激活。当加入Wnt/β-catenin阻断剂DKK1后,LPS刺激下减弱的PDLSCs的成骨能力可以得到部分的恢复。6)在大鼠体内,阻断TLR4或NF-κB通路能够有效地减少LPS所造成的牙周缺损。LPS在大鼠体内造成的牙周骨缺损能够通过阻断TLR4或NF-κB部分逆转,同时又由于ALP染色结果显示牙周组织成骨能力增强,而Trap染色结果显示各组的破骨细胞数量无明显差异,因此各组牙周骨量的差异很可能是由于各组之间的成骨能力差异所造成的。