副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是定植在猪上呼吸道的革兰氏阴性条件致病菌，是导致保育猪死亡的重要病原菌之一。在外界条件发生变化并导致猪群受到应激或者一些免疫抑制性疾病的流行，副猪嗜血杆菌可以侵入肺部造成肺炎，并由肺部扩散到全身组织引起多发性浆膜炎。在肺部组织中，肺泡巨噬细胞在宿主的第一道防线中发挥重要作用，而肺泡巨噬细胞可以分泌促进炎性物质(Interleukin8, IL-8)，巨噬细胞炎性蛋白(Macrophage inflammatory protein-1β, MIP-1β)以及抗菌物质如活性氧类(Reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(Nitric oxide, NO)来防御病原菌的入侵。然而，副猪嗜血杆菌扩散到全身组织需要在肺部建立感染，那么其需要克服肺泡巨噬细胞分泌的各类抗菌物质，如一氧化氮。目前，一氧化氮在副猪嗜血杆菌感染肺泡巨噬细胞后，其产生的机制仍不清楚。　　本研究主要内容包括：⑴副猪嗜血杆菌能否刺激3D4/21细胞产生一氧化氮，采用不同感染剂量以及不同菌体状态(细菌热灭活与否)的副猪嗜血杆菌刺激3D4/21细胞，通过 Griess reaction的方法，检测细胞培养上清中一氧化氮的含量。结果发现：副猪嗜血杆菌活菌可以诱导3D4/21细胞产生一氧化氮并呈剂量依赖关系，而热灭活的副猪嗜血杆菌不能诱导3D4/21细胞产生一氧化氮。⑵副猪嗜血杆菌刺激3D4/21细胞产生一氧化氮是通过哪种一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS)来实现的？采用感染剂量为MOI～100的副猪嗜血杆菌刺激3D4/21细胞，通过荧光定量 PCR的方法，检测神经型、可诱导型以及内皮型一氧化氮合成酶的表达。结果发现：副猪嗜血杆菌能显著上调可诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, NOS2)的表达。⑶通过添加外源一氧化氮的方法，检测一氧化氮对副猪嗜血杆菌生长的影响，以及用荧光定量PCR方法检测细胞色素c亚硝酸盐还原酶表达。结果发现：一氧化氮可以显著影响副猪嗜血杆菌生长，以及亚硝酸盐还原酶表达。⑷外源添加的一氧化氮以及副猪嗜血杆菌刺激细胞产生的一氧化氮，其对3D4/21细胞趋化因子产生是否有影响？首先，通过添加外源一氧化氮供体检测其对3D4/21细胞趋化因子的影响；使用NOS抑制剂1400W作用细胞后，再加入副猪嗜血杆菌刺激细胞，荧光定量 PCR检测趋化因子的变化。结果发现：内源与外源性的一氧化氮对3D4/21细胞趋化因子产生具有一定的影响。⑸IFN-γ在人源或者鼠源性细胞能增强NOS2的表达，对于猪肺泡巨噬细胞能否具有相同的功能？对胞内一氧化氮用探针DAF-FM DA进行标记，并在荧光显微镜下观察荧光，同时结合荧光定量 PCR的方法，检测 IFN-γ对副猪嗜血杆菌诱导3D4/21细胞NOS2表达以及胞内一氧化氮的产生影响。结果发现：IFN-γ能增强副猪嗜血杆菌诱导细胞NOS2表达以及胞内一氧化氮的产生。⑹副猪嗜血杆菌通过什么信号通路来调控一氧化氮的产生。通过Western blot和免疫荧光方法，检测副猪嗜血杆菌刺激3D4/21细胞后，IκB-α降解、p65磷酸化以及p65进入细胞核的变化。通过在细胞中添加NF-κB抑制剂，检测细胞上清一氧化氮含量，以及荧光定量 PCR检测 NOS2的表达。结果显示：副猪嗜血杆菌可以激活NF-κB，以及诱导p65进入细胞核，并且NF-κB抑制剂能降低上清中一氧化氮含量以及NOS2转录。