研究背景糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)病程缓慢,并发症多且常累及心、脑、肾等全身重要脏器,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)为常见、严重的并发症之一。DM糖脂代谢紊乱可导致心肌组织病理改变为心肌细胞肥大、凋亡、坏死,间质纤维化,炎症等,表现为进行性左心室结构改变、功能异常,死亡率极高。DM治疗现状目前并不乐观,仍存在诸多间题,单纯降低血糖治疗并不能完全降低心血管病事件。因此,新型降糖药物除具有保护胰岛β细胞功能、降糖作用外,还应具有保护靶器官、降低死亡率的作用,成为当前基础研究与临床治疗策略的重点。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是主要源于肠道末端L细胞分泌的肠促激素,受体在胰岛、心肌、脑等组织内广泛表达,作用在机体摄入食物后,具有葡萄糖依赖性释放、促进餐后胰岛素分泌等作用。2型DM患者体内,GLP-1分泌水平或活性显著F降,且内源性GLP-1可被二肽基肽酶(DPP-Ⅳ)快速分解。因此,DPP-Ⅳ抑制剂-西格列汀可使内源GLP-1短期不被降解,具有升高GLP-1水平,增强并延迟胰岛素释放来降低血糖。晚近报道证实GLP-1可抑制缺血／再灌注损伤后的细胞凋亡报道DPP-Ⅳ抑制剂可上调GLUT-4的表达,GLP-1受体兴奋剂可降低2型DM患者高甘油三酯血症、逆转脂肪肝。DM心肌病变中Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积、排列紊乱,胶原降解酶(主要基质金属蛋白酶系统MMPs/TIMPs)表达异常,晚近报道,GLP-1受体拮抗剂可抑制脂多糖诱导心肌细胞表达MMP-9,提示可能影响胶原酶的表达。心脏舒张功能不全病人外周血中DPP-Ⅳ活性与超声参数E／E’比值呈正相关。GLP-1受体激动剂可抑制TGF-β1表达。尚未见DPP-Ⅳ抑制剂影响DM大鼠糖脂代谢、心肌脂质含量以及心肌胶原网络代谢的相关研究。心肌细胞凋亡、坏死广泛存在于DM心肌组织中。DM心肌组织中TNF-α、IL-6表达增加,TNF-α与细胞膜TNFR1结合形成信号转导复合物,可引发细胞内Bax.Bcl-2等基因异常表达,致细胞凋亡。受体相互作用蛋白家族(RIPs)是一类重要调节细胞死亡、存活的信号分子,其中RIP3具有自磷酸化、诱导细胞凋亡与激活NF-kB的作用,是参与TNF-α介导的死亡受体凋亡通路的重要信号分子,且RIP3与线粒体能量代谢有关。DM心肌细胞凋亡中,,RIP3是否参与其中，及DPP-Ⅳ抑制剂对DM心肌细胞凋亡、RIP3表达的影响以及两者的相关性,目前尚未见相关报道。DPP-Ⅳ抑制剂(西格列汀)通过抑制DPP-Ⅳ活性,提高GLP-1水平、发挥其生物学作用。因此,在既往研究基础上,本部分从动物水平研究西格列汀对DM大鼠心肌组织的炎症、胶原网络代谢、脂质含量及心肌细胞凋亡等病理改变的影响;对DM心肌组织中RIP3的表达及与凋亡的关系：并探讨该药对DM大鼠左心室功能的影响。通过本研究为DM的防治提供更多的方法。研究目的1.探讨DPP-Ⅳ抑制剂对DM心肌组织的炎症反应、胶原网络代谢、脂质含量及心肌细胞凋亡等心肌重塑的影响；2.初步探讨RIP3在DM心肌中的表达及DPP-Ⅳ抑制剂的干预作用;3.评价DPP-Ⅳ抑制剂对DM大鼠左心功能的影响。研究方法1.DM大鼠模型的构建、分组及药物干预8周龄雄性Wistar大鼠70只,随机分为四组：对照组(n=10只)[Control]；糖尿病组(n=20只)[DM];糖尿病+DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀组[(低剂量组,30mg/kg/d)(n=20只)[DPP-IVi(Low)]；糖尿病+DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀组(高剂量组,50mg/kg/d)(n=20只)[DPP-IVi(High)]。糖尿病各组高脂饲养4周(w)后,糖尿病各组大鼠腹腔注射小剂量STZ30mg/kg.2型糖尿病大鼠成模的诊断标准为：STZ注射后1周内,连续2次空腹血糖≥11.1mmol/L,为糖尿病模型。模型稳定后持续4w,给予对照组、DM组予以生理盐水灌胃,DM药物干预两组分别给予不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀研钵碾碎生理盐水稀释后灌胃,均再继续喂养到实验结束,处死称取心脏重量,计算心脏重量／体重[HW/BW(mg/g)]比值后,留取标本。2.各组大鼠基本指标、糖脂代谢系列指标及GLP-1水平的监测实验过程中除常规每2周测1次心率、体重、血压与血糖外,期间,根据研究需要,各时间点为0、4、5、9、13、17、21w,抽取颈静脉窦血1.5ml左右,分离血清,全自动生化分析仪测定血总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇水平,以及免疫发光法测定糖化血红蛋白,酶联免疫法法测血清FFA、GLP-1水平,以及空腹血清胰岛素水平,计算胰岛素敏感指数。3.心电图根据实验不同时间点,描记肢体导联(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF)心电图,观察各组大鼠心脏电活动情况并记录心电图。4.超声心动图分别在0、13w、7w、21w不同时间点进行超声心动图检查,测定指标如下：左室收缩末内径(LVIDs)、左室舒张末内径(LVIDd)、射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)；二尖瓣口E波最大速度、A波最大速度、E／A；组织多普勒(TDI)二尖瓣环左室侧壁测E’波最大速度、A’波最大速度,E’／A’,并计算E／E’。5. Millar导管测左心功能暴露左室心尖部后,利用10ml注射器针头,内有Milllar导管电极探头直接行心尖穿刺精确控制插入左心室,软件分析心血管参数,左室收缩压(LVSP),左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp／dt)、左室内压最大下降速率(-dp/dt)。记录、导出有关数据、图像资料,并计算左室松弛时间常数Tau=P/(-dp/dt)。66.心肌组织病理学检测实验结束处死动物后,进行取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片,常规HE染色、Masson染色及天狼星红染色,观察心肌组织结构、细胞形态、胶原分布情况等。油红O染色用冻存心肌组织标本。以3%戊二醛固定心肌组织后行透射电镜观察。并测心肌羟脯氨酸含量计算胶原含量。7. TUNEL染色石蜡切片行免疫组化法检测凋亡细胞,显微镜下观察、计数阳性染色细胞即凋亡细胞百分比数,并进行统计分析。8.免疫组织化学染色取心肌组织石蜡切片,分别免疫组化检测左心肌组织炎性因子TNF-α、IL-6,胶原Ⅰ、Ⅲ与胶原降解酶MMP-1、9,以及RIP3的表达,并进行综合分析。9.实时定量RT-PCR基因水平检测取-80℃冻存的心肌组织,Trizol法提取心肌组织总RNA,实时定量RT-PCR技术检测RIP3mRNA的表达水平。10. Western blot检测取-80℃保存的心肌组织,提取总蛋白,Western-Blot (?)检测左室心肌组织内GLP-1含量及其受体表达,炎性因子TNF-α、IL-6,胶原Ⅰ、Ⅲ,部分胶原降解酶MMP-1、9,以及RIP3的蛋白表达。11.统计学分析所用数据用SPSS17.0统计软件进行分析。数值变量资料数据以均数±标准差表示,两组间均数比较采用小样本t检验,多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.大鼠的一般情况糖尿病大鼠造模中,共4只未达标准予以剔除,整个实验中共死亡8只,均为糖尿病各组,最终58只大鼠最终完成实验。其中,Control组10只；DM组15只;DM+DPP-IVi (Low)组16只;DM+DPP-IVi (High)组17只。对照组精神状态好,体重增加,反应敏捷,毛色白而光泽。DM组出现多饮、多尿和消瘦症状,精神差,体重增加迟缓甚至下降,皮毛脏乱无光泽。药物干预后的两组,与DM组相比,一般情况均较好。实验开始时,各组大鼠心率、体重和血压均无差异(P>0.05)。结束时,DM各组与对照组比较,体重下降(P<0.01-0.05),心率、血压升高(P<0.01-0.05)；药物干预后的两组与DM组比较,体重增加及心率、血压不同程度下降(P<0.01-0.05)。2.血液指标检测结果2.1各组糖脂代谢指标的比较造模前、高脂饲养4周后,糖尿病各组存在胰岛素抵抗状态；造模后整个实验过程中,DM组与对照组比较,FBG水平、上午10：00血糖水平及HbA1c,均显著升高(P<0.01)：药物干预后的两组与DM组比较,均不同程度下降(P<0.01-0.05)；造模成功后1周FINS无显著差异,ISI显著下降(P<0.05)；实验末,DM组与对照组、两药物干预组比较,FINS显著下降(P<0.01-0.05)；ISI在实验第5-21周,DM组与对照组比较,显著下降(P<0.05)。糖尿病造模成功后整个实验过程中,DM各组较对照组,血TC、TG、LDL-C、FFA水平均明显升高(P<0.01-0.05)；药物干预后的两组与DM组比较,均不同程度的降低(P<0.01-0.05)。2.2检测空腹、口服葡萄糖30min后GLP-1的血浆水平糖尿病造模成功并且模型稳定后,于第8周开始给予药物干预,DM与对照组比较,分别空腹、口服葡萄糖30min后GLP-1血浆水平均呈不同程度降低(P<0.01-0.05)；药物干预后的两组与DM组比较,在第13-21周,空腹、口服葡萄糖30min后,GLP-1血浆水平均有不同程度的升高(P<0.01-0.05),尤其DM组给予高剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后,与对照组比较,无显著性差异(P>0.05)。3.心电图的变化对照组ECG清晰可见P、QRS、T波,QRS波振幅一致。DM组10只心电图异常表现,占66.67%,且QRS“电交替”现象多见,另可见室上速、室速、心动过缓等各种复杂心律失常；两药物干预组中,心电图异常总计14只,占42.42%,未见复杂心律失常且“电交替”减少,提示DPP-Ⅳ抑制剂可改善心脏电活动。4.超声测量心脏结构和功能指标的变化左心结构的改变：实验开始时,各组之间左心腔室大小,LVIDs及LVIDd均无显著性差异(P>0.05)；实验结束时,DM组与对照组比较,LLVIDs及LVIDd (?)(?)显著扩大(P<0.05);药物干预后的两组与DM组比较,LVIDs及LVIDd均明显减小(P<0.05)左室收缩功能的评价：实验开始时,各组大鼠间FS和EF的变化均无显差异(P>0.05)。实验结束时,DM组与对照组比较,FS、LVEF均不同程度降低(P<0.0l-0.05)；药物干预后的两组与DM组比较,FS、LVEF均不同程度升高(P<0.01-0.05)。左室舒张功能的评价：实验开始时,各项指标均无显著差异(P>0.05);DM组与对照组比较,第13w开始至21w实验结束时,E／A、E’／A’比值不同程度降低(P<0.01-0.05)；E／E’比值不同程度升高(P<0.01-0.05);药物干预后的两组志DM组比较,E／A、E’／A’比值不同程度升高(P<0.01-0.05),E／E’不同程度降低(P<0.01-0.05)。5. Millar导管测量各组左室功能指标的比较与对照组比较,DM组LVSP明显下降(P<0.01)、LVEDP升高(P<0.01)、±dp/dt max绝对值降低(P<0.01-0.05)及Tau绝对值延长(P<0.01)。与DM组比较：LVSP在大剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后明显升高(P<0.05),在两组DPP-Ⅳ抑制剂干预后,+dp/dt max (mmHg/s)(?)匀升高(P<0.05),ILVEDP均显著下降(P<0.05),-dp/dt max (mmHg/s)绝对值均升高(P<0.05),左室松弛时间常数(Tau)绝对值不同程度缩短(P<0.01-0.05),大剂量药物干预组Tau缩短更显著。6.DM大鼠左室心肌重塑及DPP-Ⅳ抑制剂的影响6.1大体标本病理改变及HE染色DM组与对照组比较,心脏标本大体形态表现体积较大,HW/BW (mg/g)较大(P<0.05)；HE染色可见左室心腔扩大、室壁肥厚；细胞横截面积明显增加(498.37±14.31vs347.84±12.27μm3, P<0.01);HE染色可见,心肌细胞肥大,可见肌纤维排列紊乱、断裂现象,形态不规则,核大小不均。药物干预后的两组与DM组比较,心脏体积、HW/BW (mg/g)比值变小(P<0.05)；左室心腔缩小,肥厚减轻；心肌细胞横截面积不同程度减少(P<0.01-0.05); HE染色可见心肌细胞体积不同程度减小,细胞排列较规则、有序,核大小尚均一,高剂量药物组则改善更明显。6.2DPP-Ⅳ抑制剂对DM心肌组织GLP-1含量、GLP-1R表达的影响实验结束时,Western-Blot提示：与对照组比较,DM组心肌组织GLP-1含量显著降低(P<0.0),GLP-1R表达也减少(P<0.01)；药物干预后的两组与DM组比较,心肌组织GLP-1含量、GLP-1R表达均不同程度升高(P<0.01-0.05),提示DPP-Ⅳ抑制剂干预后,心肌组织内GLP-1含量升高,且可提高GLP-1受体表达的密度。6.3DPP-Ⅳ抑制剂减少DM心肌组织胶原的含量Masson染色所见：DM组与对照组大鼠比较,胶原纤维粗大,排列紊乱,分布不均,沉积增多；药物干预后的两组与DM组比较,沉积的心肌胶原减少,排列尚有序、分布也尚均匀。天狼猩红染色所见：DM组与对照组比较,心肌组织内胶原纤维较明显增加,排列紊乱,且可见不规则网状胶原纤维围绕在小动脉周围;药物干预后的两组与DM组比较,可见心肌组织胶原沉积减少。胶原含量比较：与对照组比较,DM组左室心肌组织胶原含量(15.86±0.43vs7.06±0.31μg/mg, P<0.01)、胶原容积分数(CVF%)(4.8±0.49vs0.47±0.06,P<0.01-0.05)以及血管周围胶原面积／管腔面积比(PVCA/LA)(2.74±0.37vs0.5±0.02,P<0.01-0.05)均不同程度升高。药物干预后的两组与DM组比较,左室心肌组织胶原含量均不同程度减少。免疫组化染色：DM组心肌组织与对照组比较,Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性表达显著增加；不同剂量DPP-IV抑制剂干预后,可见心肌组织棕色颗粒不同程度减少。Western-Blot:DM组与对照组比较,心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达显著升高(P<0.01),药物干预后的两组与DM组比较,均可见心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达不同程度降低(P<0.01-0.05)。6.4DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病大鼠心肌胶原酶MMP-1、9表达的影响免疫组化染色：DM组与对照组比较,MMP-1、9阳性表达显著增加。不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后,心肌组织棕色颗粒不同程度减少。Western-Blot:DM组与对照组比较,心肌组织MMP-1、9蛋白表达显著升高(P<0.05),药物干预后的两组与DM组比较,心肌组织MMP-1、9表达均不同程度降低(P<0.01-0.05)。6.5DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病大鼠心肌组织炎性因子TNF-α、IL-6表达的影响免疫组化染色：对照组心肌细胞浆内见少量、稀疏的浅棕色颗粒；DM组心肌细胞胞浆内可见较多浓密深棕色颗粒。与DM组比较,不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后,可见心肌组织棕色颗粒分布散在、稀疏，有不同程度减少。Western-Blot:DM组与对照组比较,心肌组织TNF-α、IL-6蛋白表达显著升高(P＜0.01),药物干预后的两组与DM组比较,心肌组织TNF-α、IL-6蛋白表达均下降(P<0.05)。6.6DPP-Ⅳ抑制剂减少DM心脏脂质的沉积油红O染色结果,与对照组比较,DM组心肌脂肪含量(7.03±0.31vs0.32±0.01,P<0.01)、心外膜脂肪组织含量(12.76±0.48vs0.47±0.03,P<0.01)均显著升高；药物干预后的两组与DM组比较,可见心肌组织脂肪含量、心外膜脂肪组织含量均呈不同程度减少(P<0.01-0.05)。6.7糖尿病心肌组织RIP3的表达及IDPP-Ⅳ抑制剂的干预免疫组化染色：DM组与对照组比较,RIP3棕黄色阳性颗粒表达增加,且分布在细胞核周围较多,不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后,细胞内棕黄色阳性颗粒表达不同程度减少。实时定量RT-PCR、Western-Blot检测：与对照组比较,DM组大鼠心肌组织RIP3mRNA水平、蛋白水平表达均显著增高(P<0.01);药物干预后的两组与DM组比较,RIP3mRNA水平、蛋白水平表达均不同程度降低(P<0.01-0.05)。6.8透射电镜观察DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病心肌细胞超微结构的影响DM心肌细胞核形状不规则,核固缩,染色质聚集,呈现凋亡细胞的早期表现；对照组心肌细胞核仁清晰可见,核膜光滑、完整。药物干预后的两组,细胞核未见明显染色质聚集,无核固缩表现,核膜尚完整、光滑。6.9TUNEL染色观察DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病心肌组织细胞凋亡发生率的影响与对照组比较,DM组左室心肌组织凋亡细胞阳性率显著增加(P<0.01),药物干预后的两组与DM组比较,细胞凋亡发生率显著减少(P<0.01)。6.10初步分析糖尿病心肌组织RIP3mRNA表达与细胞凋亡率的相关性结合糖尿病心肌组织RIP3mRNA表达与糖尿病心肌组织细胞凋亡百分率,初步分析糖尿病大鼠心肌组织RIP3mRNA表达与细胞凋亡百分率的相关性,得知Pearson相关系数r=0.795(P<0.00]),可以初步判断糖尿病大鼠心肌组织细胞凋亡百分率与RIP3mRNA的表达呈显著正相关。研究结论1.DPP-Ⅳ抑制剂影响DM心肌组织炎症反应、胶原代谢、脂质含量及心肌细胞凋亡的改变,逆转DM心肌病理性重塑；2.DM心肌组织中,RIP3表达上调,且与心肌组织细胞凋亡率呈显著正相关；DPP-Ⅳ抑制剂可干预DM心肌组织中RIP3过表达,抑制心肌细胞凋亡;3.DPP-Ⅳ抑制剂可显著降低DM大鼠左室E／E’,降低左室舒张末压(LVEDP)和-dp/dt max,增加LVEF和+dp/dt max,缩短Tau。显示DPP-Ⅳ抑制剂明显改善DM大鼠左心室收缩和舒张功能。研究背景细胞凋亡系基因调控、主动、程序性死亡的病理生理过程,对维持机体内环境稳态极其重要,糖尿病(DM)心肌病变的主要病理改变之一是心肌细胞凋亡,且随凋亡细胞的增多,最终导致心肌组织重构与心脏功能障碍。新近研究证实,RIPs (receptor-interacting protein)家族作为一类重要的调节细胞生存、凋亡、坏死的信号分子备受重视,其中RIP3具有自磷酸化、诱导细胞凋亡和激活NF-kB的作用。多种细胞株中过表达RIP3,则会发生细胞凋亡。报道RIP3是TNF-a诱导的细胞凋亡-坏死转换的“分子开关”,且RIP3与线粒体能量代谢、ROS产生等密切相关。RIP3调节能量代谢相关酶相互作用,并产生过量ROS诱发细胞程序性坏死。因此,RIP3参与细胞内多种信号通路,并发挥重要的生理功能。结合课题第一部分的研究,发现DM心肌组织中存在RIP3表达上调,且与心肌组织细胞凋亡率呈显著正相关。但是,高糖刺激下,线粒体功能异常,细胞能量供给障碍,RIP3参与能量代谢相关酶的作用、活性异常等,影响线粒体功能及膜电位改变介导心肌细胞调亡的研究目前国内外尚未见相关报道。晚近报道,胰高血糖素样肽-1(GLP-1)除降糖作用外,尚具有抑制缺血／再灌注后心肌细胞凋亡、改善心肌梗死后心力衰竭的作用。且GLP-1可能通过激活PI3K、 MAPK信号通路抑制胰岛细胞发生凋亡。课题第一部分动物水平研究发现,DPP-Ⅳ抑制剂通过提高GLP-1水平可抑制DM心肌组织中RIP3过表达、并降低心肌细胞凋亡率。既往研究表明,高糖可直接刺激,或引发Bcl-2表达改变,启动线粒体损伤信号通路,导致线粒体膜通透性增加,线粒体内的细胞色素C释放入胞质,启动caspase级联反应,细胞调亡。但是,国内外尚未见高糖环境中GLP-1对RIP3表达的调节及是否参与以上凋亡通路的研究。因此,基于既往报道与课题第一部分动物水平的研究,本部分从细胞水平研究提出可能存在的假设：RIP3高表达参与糖尿病心肌细胞TNF-α介导的死亡受体活化的凋亡通路；也参与线粒体损伤的凋亡通路,RIP3直接或间接(通过调节能量代谢过程中产生过量ROS)使线粒体膜通透性改变,线粒体内细胞色素C释放入胞浆,激活型Caspase-3表达增加,发生细胞调亡;而沉默RIP3可改善此病理改变；GLP-1可能通过多个信号通路干预RIP3过表达,从而抑制细胞凋亡。为进一步验证此过程,本部分采用高糖刺激心肌细胞发生凋亡过程中,探讨RIP3在此过程中表达的改变及GLP-1对其影响以及可能存在的机制,为阐明GLP-1、RIP3参与高糖诱导的心室肌细胞凋亡及可能的相关信号通路提供理论依据。研究目的1.验证高糖刺激可诱导心室肌细胞调亡,凋亡与RIP3表达相关；2.探讨高糖诱导心室肌细胞调亡过程中, RIP3在线粒体损伤凋亡途径中的可能作用;3.探讨高糖刺激下,GLP-1对RIP3表达的影响及可能的信号通路。研究方法1.原代心肌细胞培养与鉴定取1～3日新(?)Wistar(?)鼠心脏,分离出左心室后剪碎、胰酶消化、差速贴壁法获得心肌细胞,可见心肌细胞搏动,并进行原代心肌细胞培养。采用肌钙蛋T单克隆抗体进行免疫荧光染色、荧光显微镜下观察并鉴定为原代培养的心肌细胞。2.实验分组与干预体外模拟生理状态、糖尿病状态,加入不同的刺激因素,研究心肌细胞干预后的变化。细胞分别进行处理：心肌细胞分别用不同浓度葡萄糖(5.5、25、33.3、50mmol/L)处理：找出适合实验所需浓度、时间刺激(33.3mmol/L,72h)为高糖(HG)研究对象；分别HG组加入Control siRNA、RIP3siRNA及不同浓度GLP-1干预后孵育细胞,并设计相应对照组。siRNA技术：采用siRNA技术抑制RIP3表达。将心肌细胞用RIP3siRNA预处理24h,再高糖刺激72h,收取细胞经流式细胞技术和Western-Blot等技术检测细胞调亡及靶蛋白的表达。3.流式细胞仪检测心肌细胞调亡采用Annexin V/PI染色流式细胞技术方法,检测心肌细胞的调亡发生情况,得出心肌细胞凋亡的发生率。4.线粒体膜电位的检测利用JC-1的方法,经激光共聚焦显微镜观察,检测线粒体膜电位荧光值变化,检测线粒体膜电位(△Ψm)的变化。5.实时定量RT-PCR检测收集细胞,提取总RNA,经逆转录反应获得cDNA,以β-actin作参照,通过实时定量RT-PCR技术检测RIP3mRNA水平的表达。6. Western-Blot检测收集细胞,提取总蛋白,分别经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、蛋白印记、显色等步骤,检测RIP3、细胞色素C、cleaved caspase3的表达。研究结果1.葡萄糖刺激心肌细胞凋亡的时间、浓度的选择5.5mmol/L[NG]、25%[HG25]、33.3%[HG33.3]、50%[HG50]不同浓度葡萄糖及甘露醇对照组[甘露醇]的培养基孵育细胞0、24、48、72h后,流式细胞仪检测凋亡示,较NG与甘露醇对照组比,HG50刺激48h(P<0.05)、72h(P<0.01)均可显著增加细胞凋亡,HG25刺激72h(P<0.05)可增加细胞凋亡。因此,高浓度葡萄糖可诱导心肌细胞凋亡,结合心肌细胞活力的结果,选用33.3%葡萄刺激72小时为研究对象。2.RIP3表达与高糖诱导心肌细胞凋亡发生的关系2.1高糖诱导心肌细胞调亡中RIP3表达升高(1)利用高浓度葡萄糖(33.3%)[HG]刺激心肌细胞72h后,收取细胞,实时定量RT-PCR及Western-Blot法检测,结果显示：与5.5%浓度葡萄糖[NG]比较,HG组RIP3在mRNA (P<0.05)与蛋白水平(P<0.05)均显著升高;(2)将原代培养的心肌细胞先应用RIP3siRNA、Control siRNA转染心肌细胞24h后,再予以高糖刺激72h,收取细胞利用实时定量RT-PCR和Western-Blot验证siRNA转染效力,结果RIP3siRNA转染组与HG组、Control siRNA转染组比较,RIP3在mRNA(P<0.05)及蛋白(P<0.05)表达水平显著下调,提示RIP3siRNA能有效抑制RIP3表达。2.2RIP3siRNA可降低高糖诱导的心肌细胞调亡发生率采用流式细胞技术分别对5.5mmol/L浓度葡萄糖组(NG)、高糖33.3%浓度葡萄糖组(HG)、HG+Control siRNA转染组、HG+RIP3siRNA转染组的心肌细胞调亡率进行检测,结果显示：NG组比较,高糖可诱导心肌细胞凋亡发生(P<0.01-0.05);与HG组、HG+Control siRNA组比较,RIP3siRNA转染后,心肌细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。提示RIP3在细胞调亡过程中发挥重要喽作用,其高表达可诱导高糖刺激的心肌细胞发生凋亡。3. RIP3高表达通过线粒体凋亡通路诱导高糖刺激的心肌细胞发生凋亡3.1RIP3siRNA对高糖环境心肌细胞线粒体膜电位(△Ψm)的影响使用激光共聚焦显微镜观察JC-1单体／聚合物(JC-1monomer/polymer)的荧光值比值,绿色荧光(单体)提示△Ψm下降,细胞凋亡前期；红色荧光(聚合体)提示△ψm较正常,细胞状态正常。与NG组比较,绿色荧光(单体)／红色荧光(聚合体)比值在HG组(P<0.05)、HG+Contro] siRNA组(P<0.05)显著升高；HG组细胞经RIP3siRNA转染后,与HG、HG+Control siRNA组比较,其比值显著下降(P<0.05)。提示高糖刺激心肌细胞凋亡中,R1P3可能影响线粒体功能,致线粒体△Ψ／m下降。3.2RIP3siRNA对高糖环境心肌细胞浆细胞色素C(Cyt C)含量、激活型Caspase-3表达的影响经Western-Blot分析,与NG组比较,HG组、HG+Control siRNA组心肌细胞浆Cyt C含量(P<0.05)、激活型Caspase-3表达(P<0.05)均显著升高；RIP3siRNA转染后,HG+RIP3siRNA组与HG、HG+Control siRNA组比较,心肌细胞浆Cyt C含量(P<0.05)、激活型Caspase-3(P<0.05)表达均显著降低。提示RIP3在高糖环境心肌细胞凋亡中参与线粒体凋亡通路。4. GLP-1对RIP3表达的调控及机制4.1GLP-1对高糖诱导心肌细胞RIP3表达的影响及信号通路Western-Blot结果显示：与单纯HG刺激组比较,HG+GLP-1(1nmol/L)组无差异(P>0.05),HG+GLP-1(10nmol/L)组RIP3蛋白表达明显下调(P<0.01)；加HG+GLP-1(10nmol/L)之前分别加MAPK阻断剂(LY294002)、PI3K阻断剂(U0126)干预的2组与HG+GLP-1(lOnmol/L)组比较,RIP3蛋白表达升高亦有明显差异(P<0.05)。提示GLP-1呈浓度依赖抑制高糖诱导的RIP3过表达,且可能部分通过MAPK、PI3K信号通路调控此过程。4.2GLP-1通过抑制RIP3表达降低高糖刺激的心肌细胞凋亡率本实验中,采用GLP-1(10nmol/L)干预、沉默RIP3分别交换先后顺序干预细胞,共5组,利用流式细胞仪结果显示,与单纯高糖刺激组(HG)比较,GLP-1干预、沉默RIP3均可降低细胞凋亡率(P<0.01-0.05)；与HG+GLP-1(10nmol/L)比较,沉默RIP3组[HG+GLP-1(10nmol/L)+RIP3siRNA、HG+RIP3siRNA、HG+RIP3siRNA+GLP-1(10nmol/L)]细胞凋亡率也显著降低(P〈0.05)；GLP-干预后沉默RIP3组与单纯GLP-1于预组比较,细胞凋亡率降低(P<0.05)；单纯沉默RIP3组与沉默RIP3后加GLP-1干预组比较,组间无统计学差异(P>0.05)。4.3GLP-1抑制RIP3表达降低高糖环境细胞浆Cyt C含量、激活型Caspase-3表达Western-Blot分析,与HG组比较,lHG+GLP-1(10nmol/L)(?)且心肌细胞浆Cyt C含量、激活型Caspase-3表达均显著减少(P<0.05)；HG分别经RIP3siRNA转染干预、GLP-1(lOnmol/L)干预后,心肌细胞浆Cyt C含量、激活型Caspase-3表达与HG组(P<0.01)、HG+GLP-1(10nmol/L)组(P<0.05)均显著减少。此实验提示GLP-1可能部分通过MAPK、PI3K(?)信号抑制RIP3表达,从而降低高糖刺激的心肌细胞凋亡率。研究结论1.高糖刺激可诱导心肌细胞调亡,同时RIP3表达增高：沉默RIP3后细胞凋亡率降低;2.高糖刺激心肌细胞凋亡中,RIP3可能通过影响线粒体能量代谢,膜电位降低、通透性增加,线粒体内细胞色素C释放入胞浆,启动Caspase级联反应,诱导细胞凋亡;3.GLP-1可能部分通过MAPK、P13K信号通路抑制RIP3表达,进而抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。