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背景:缺血型脑卒中是继心血管疾病和肿瘤之后又一类严重威胁人类健康和生命的疾病。随着我国老龄化人口逐渐增多,缺血脑卒中发病率也逐年呈上升趋势。一旦发生缺血型脑卒中,短时间内缺血即可导致神经细胞发生不可逆性坏死,遗留永久性后遗症或严重者危及生命。因此,尽快、及早恢复缺血区域内脑血流是治疗缺血型脑卒中首要原则。然而恢复血液供应后又会面临诱发缺血再灌注损伤,反而加重缺血本身所造成的脑组织损伤。因此积极预防缺血再灌注损伤对改善缺血型脑卒中患者预后的非常重要。研究表明缺血再灌注损伤包含细胞炎症、凋亡、氧化应激、细胞兴奋性毒性、酸中毒、离子失衡等多种复杂过程。CARD3蛋白属于丝/苏氨酸蛋白激酶,在人体组织内表达广泛,其m RNA高表达于脾脏、外周血白细胞、胎盘、脑和心脏,其C末端的CARD结构能够与多种蛋白发生同种蛋白相互作用。相关文献报道CARD3能够激活NF-κB和MAPK信号通路参与调节细胞炎症和凋亡,在天然免疫、获得性免疫、炎症性疾病、肿瘤、卒中等疾病中发挥着重要作用。例如,在心肌缺血再灌注损伤中,CARD3能够上调上述两条通路诱导心肌细胞坏死,CARD3还通过caspase-1诱导神经元发生缺血缺氧性损伤。因此CARD3很有可能在脑缺血再灌注损伤中发挥中重要作用。目的:通过构建小鼠t MCAO模型来构建脑缺血再灌注损伤,研究CARD3在脑缺血再灌注损伤中的作用,并进一步利用CARD3转基因小鼠和CARD3基因敲除小鼠来探索CARD3在脑缺血再灌注损伤中具体作用机制,为临床预防脑缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。材料与方法:第一部分:选用大小为10-12周的雄性C57BL/6小鼠,采用线栓法临时闭塞左侧大脑中动脉45min后再恢复其脑血流来构建脑缺血再灌注模型。分别取再灌注2h、6h、12h、24h脑组通过Western Blotting和免疫荧光染色实验方法检测体内CARD3的表达情况。同时体外分离原代SD大鼠皮层神经元,进行氧糖剥夺（OGD）刺激后后,再恢复正常培养,并通过Western Blotting和免疫荧光实验检测体外刺激后0h、3h、6h、12h、24h时神经元内CARD3的表达情况。第二部分:选用10-12周的雄性CARD3基因敲除小鼠（CARD3-KO）和野生型小鼠（WT）构建脑缺血再灌注模型,将他们随机分为假手术组（sham group）和脑缺血再灌注损伤组（I-Rgroup）,通过TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）染色和神经功能评分比较CARD3对脑缺血再灌注损伤程度的影响。通过免疫荧光染色和Western Blotting、Q-PCR检测细胞凋亡、炎症和氧化应激等指标。在体外实验中利用腺病毒介导的CARD3敲低的神经元（Adsh CARD3）与对照组（Adsh RNA）进行比较,分析乳酸脱氢酶释放和细胞活力的差异。第三部分:将CARD3全长c DNA插入到神经特异性PDGF B-chain启动子下游,通过显微注射的方法构建神经特异性CARD3过表达小鼠（CARD3-TG）。选用CARD3-TG和NTG小鼠构建脑缺血再灌注模型,将他们随机分入假手术组和脑缺血再灌注组（I-R组）,通过TTC染色、神经功能评分比较其损伤程度;通过免疫荧光染色和Western Blotting、Q-PCR检测细胞凋亡、炎症和氧化应激等指标。第四部分:通过免疫蛋白印记分别检测CARD3基因敲除或过表达时对脑缺血再灌注诱导MAPKs家族中的JNK、p38、ERK信号通路及其上游调节分子TAK1的影响。第五部分:选用NTG和CARD3-TG小鼠,在手术前静脉注射TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol后再构建脑缺血再灌注损伤模型,而对照组予注射相同剂量DMSO,通过TTC染色、神经功能评分来评分TAK1抑制对缺血再灌注损伤的影响,通过Western Blotting检测炎症、凋亡、氧化应激等指标。结果:第一部分:体内实验结果显示在脑缺血再灌注损伤后CARD3的表达明显升高,且上升趋势与再灌注时间呈依赖性。免疫荧光结果显示在缺血侧大脑半球,皮层和纹状体区域内CARD3阳性的细胞数目多于对侧大脑半球相应区域,p<0.05;体外原代神经元在OGD刺激后CARD3的表达也明显升高。第二部分:CARD3基因敲除缓解了小鼠脑缺血再灌注损伤。在缺血再灌注24h和72h进行TTC染色结果显示:与WT组相应时间点相比,CARD3-KO组在24h和72h梗死面积分别减少42.18%和49.27%,p<0.05,神经功能评分分别减少了40.91%和31.43%,p<0.05;梗死24h后脑组织进行Fluoro Jade B和Tunel染色检测细胞凋亡情况,结果显示,CARD3-KO组中Fluoro Jade B和Tunel阳性细胞数量较WT组明显减少,p<0.05;同时体外细胞实验显示:与转染Adsh RNA组相比,转染Adsh CARD3组的原代神经元在OGD刺激12h后释放的LDH含量降低,而细胞活性明显升高。Q-PCR和Western Blotting结果显示:促凋亡相关因子Bax、bid、caspase-3在CARD3-KO组中表达低于WT组;而Bcl2表达高于WT组;炎症相关因子中p-IKKβ和p-p65在CARD3-KO组中明显低于WT组,IKBa表达高于WT组;在氧化应激中,抗过氧化物酶HO-1、Nrf-2、SOD1/2在CARD3-KO中明显升高;而过氧化物酶p47-phox、p67-phox、gp91-phox在CARD3-KO组中表达下调。第三部分:CARD3过表达加重了小鼠脑缺血再灌注损伤。在缺血再灌注24h和72h进行TTC染色结果显示:与NTG组相比,CARD3-TG组在24h和72h梗死面积分别增加了67.01%和58.04%,神经功能评分分别升高了32.26%和29.79%,p<0.05;梗死24h后Fluoro Jade B和Tunel染色结果显示,CARD3-TG组中Fluoro Jade B和Tunel阳性细胞数量较NTG组明显增多,p<0.05;促凋亡相关蛋白Bax、Bid、caspase-3在CARD3-TG组中表达高于NTG组;而Bcl2表达低于NTG组;炎症信号通路中p-IKKβ和p-p65在CARD3-TG组中明显高于NTG组,IKBa表达低于NTG组;在氧化应激反应中,抗过氧化物酶HO-1、Nrf-2、SOD1/2在CARD3-TG中明显降低;而过氧化物酶p47-phox、p67-phox、gp91-phox在CARD3-TG组中表达上调。第四部分:Western Blotting结果显示:与WT相比,CARD3-KO组中,p38和JNK的磷酸化水平显著降低;而ERK无明显变化;相反,当CARD3过表达时,p38和JNK磷酸化水平显著增强。JNK和p38上游激酶p-TAK1表达在CARD3-KO组中被抑制,而在CARD3-TG中明显增强。第五部分:静脉注射5Z-7-oxozeaenol能够明显抑制p-TAK1的表达。TTC结果显示:与DMSO组相比,TAK1抑制剂能够显著降低CARD3过表达引起的脑梗死面积的扩大。从分子机制上,CARD3-TG组中TAK1抑制剂预处理后JNK和p38磷酸化水平明显低于对照组（DMSO）;炎症相关因子p-IKKβ、p-p65、促凋亡因子以及过氧化物酶p47-phox和p67-phox也同样被显著抑制,而抗凋亡蛋白Bcl2、抗过氧化物酶HO-1和SOD1表达明显上调。结论:（1）CARD3参与脑缺血再灌注损伤,在缺血再灌注损伤后其表达上调,并与再灌注时间呈依赖关系;（2）CARD3敲除后抑制缺血再灌注损伤介导细胞的凋亡、炎症和氧化应激过程;（3）CARD3过表达加重了缺血再灌注损伤介导的凋亡、炎症和氧化应激反应;（4）CARD3通过TAK1来调节JNK和p38 MAPK信号通路来促进脑缺血再灌注损伤。