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在过去的几十年间,研究人员用农杆菌转化法获得了多种转基因植物,该转化法依赖于农杆菌中存在的Ti质粒。目前应用较多的是传统双元载体和Gateway系统,但是传统双元载体使用时较复杂浪费时间,而Gateway系统虽然使用方便但是价格较昂贵,并未大量采用。在使用传统双元载体时经常会遇到多种问题:酶切位点不合适、同时连入多条片段困难等。而LIC双元载体可以弥补这些不足,并且使用价格便宜,但是用于单子叶植物转化的LIC双元载体并没有得到发展。
因此,本文以pCAMBIA和pGA系列载体为基础,构建了一组用于单子叶植物转化的LIC双元载体,可用于基因表达分析、蛋白定位分析和启动子功能分析。这是一组可以快速构建的载体,且使用价格便宜。这套载体使用时不需要考虑多克隆位点的酶切位点是否合适,任何片段只须加15bp的特异接头即可连入载体,且每套载体均有Bar和Hyg两种抗性标记基因,所以同一基因可以同时连入两个载体用于不同植物的转化。并且,这套载体用于菌体筛选的抗性标记基因是Kan抗性基因,Kan相对稳定,筛选效率高,使用方便有效。这组载体为以后的顺利实验奠定了基础。
植物基因工程是水稻抗病育种的重要方式,这种方式可以在不改变水稻原始性状的基础上使转基因植株获得预想的抗性性状。为了提高植物的抗病性,不同来源的抗性基因以被转化进入植物,包括植物本身的抗病通路的基因,以及来源于植物和非植物的抗菌肽基因。抗菌肽具有独特的抗菌机制,且具有广谱抗菌性,能作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,但是对正常的真核细胞几乎没有作用,且不易产生耐药性。将抗菌肽基因转化进入植物使植物获得抗病性已有较多的成功例子。
本文首先通过对农杆菌转化过程进行优化,使转化效率得到了较大的提高。将来源于中国明对虾的三种抗菌肽基因(ALF、WAP、Penaeidin)转化水稻,经检测,分别获得T0代转基因植株5、7、2棵,经PCR扩增、SouthernBlot杂交验证与抗除草剂表型鉴定分析,证明目的基因稳定存在于T1代转基因植株基因组中。基于抗菌肽的广谱抗菌性,可以对已获得的转基因植株进行抗病性分析,期望能提高水稻的抗病性。