γ干扰素（IFN-γ）主要由被抗原、有丝分裂素（ConA，PHA）等活化的Th₁细胞、CD8⁺细胞和NK细胞产生，除具有抗病毒、抗肿瘤活性外，还具有免疫调节作用，如活化巨噬细胞、提高MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达、促进抗原提呈等，在机体免疫控制和免疫病理中起着重要的作用。研究表明，外源性的IFN-γ既可以作为药剂用于感染性疾病或肿瘤等的治疗，又可以作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果；内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。对应，抗IFN-γ的单克隆抗体（McAb）作为研究、检测IFN-γ的手段，在免疫机制研究、免疫功能检测等领域具有广泛的应用。IFN-γ的免疫学检测（IFN-γ试验）是在特异性抗IFN-γ McAb的基础上建立的用于对样本中的IFN-γ进行定性定量分析的实验方法，已被广泛地用于基础研究和临床免疫学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及胞内病原感染的诊断等。IFN-γ及其McAb在畜牧兽医领域也有着广泛的应用。国外已有学者将基因重组牛IFN-γ（rBovIFN-γ）及其McAb用于牛病的研究，抗原特异性的牛IFN-γ试验已在很多发达国家被用于多种牛疫病的检测，尤以在牛结核病诊断中的应用最为广泛，相关的研究也最为深入，国内这方面研究的报道比较少。最近几年来，随着基因克隆、重组、表达及单克隆技术的不断发展、成熟，通过基因工程手段制备rBovIFN-γ并在此基础上制备其McAb成为可能。本实验克隆并表达BovIFN-γ，制备抗牛IFN-γ单克隆及多克隆抗体，建立可检测牛IFN-γ的双抗体夹心间接ELISA方法。 1．BovIFN-γ在大肠杆菌中的表达及其产物的鉴定 通过PHA刺激，从全血培养上清提取BovIFN-γ mRNA，根据BovIFN-γ基因的已知序列设计引物，经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ cDNA，定向插入原核表达质粒pET-28a（+），构建原核表达重组质粒，经测序确认，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，表达出大小在22kDa左右的蛋白；并对表达条件进行了优化。 2．rBovIFN-γ McAb的制备与鉴定 本研究以纯化的原核表达融合蛋白BovIFN-γ为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出4株稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株，分别命名为A7、A10、G6、G10，免疫球蛋白亚类鉴定都为IgG₁，腹水效价为1∶2⁹×100、1∶2¹⁰×100、1∶2⁹×100、1∶2⁹×100，Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合22kDa的BovIFN-γ，ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应，而不与Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF反应，表明4株单抗均为针对BovIFN-γ的特异性单抗。