结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.Tb)是引起结核病(Tuberculosis,TB)的病原体。目前结核病的防治形势依然严峻。2015 WHO统计报告指出,2014年的结核病新增病例超过960万,死亡病例达150万,呈增加趋势。这主要是由于结核病的传播途径为空气的飞沫传播,易于传染;此外,近年出现了多重耐药性及极度耐药性M.Tb菌株的感染,使对结核病患者的治疗困难。因此要治愈结核病,克服耐药的M.Tb感染,有必要寻找有效的抗结核新药或新的药物靶点。M.Tb细胞壁结构特殊,对分枝杆菌的生存和繁殖极为重要,因而影响细胞壁完整性的因素,常为寻找和设计抗结核新药的理想靶点。分枝杆菌细胞壁核心结构为mAGP(Mycolic acid-Arabinogalactan-Peptidoglycan),是由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖三种组分共价连接形成。肽聚糖是其中重要的组成成分,其完整性影响细菌的增殖和生存。本文研究的靶向分子DdlA(D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶)为影响肽聚糖生物合成过程中的供体D-丙氨酰-D-丙氨酸的供给。D-丙氨酰-D-丙氨酸是以D-丙氨酸为原料,由DdlA催化形成的。因此选取M.Tb基因组中的ddlA基因(Rv2981c)作为研究对象,因其所编码的DdlA直接影响肽聚糖的多肽链的合成,进而影响肽聚糖的交联与成熟。2003年,Sesseti的转座子突变结果表明ddlA基因为M.Tb生长必需基因;此外,目前应用于临床的二线抗结核药物D-环丝氨酸即以DdlA为作用靶点,但该药物由于严重的神经系统副作用而使其在治疗结核病的应用中颇为受限。综上表明,DdlA是良好的抗结核药物作用靶向位点,对其进行研究具有重要的理论和实践意义。本文的研究策略:1.获取rv2981c基因序列信息,体外表达tb-ddla蛋白,并建立能应用于筛选抑制剂的酶分析体系。在大肠杆菌表达体系中诱导、表达并纯化ddla蛋白及鉴定其d-丙氨酰-d-丙氨酸连接酶酶活性;建立酶活性分析体系,为ddla抑制剂的筛选提供基础;同时以ni-nta亲和层析纯化的蛋白制备其多克隆抗体,以期用于对sm-ddla反义下调表达模型的验证。2.通过比对分析获取rv2981c(ddla)在耻垢分枝杆菌中的同源序列m.smeg-2395(ddla),构建其反义rna下调表达的耻垢分枝杆菌菌株模型,以强力霉素诱导,绘制经反义rna下调表达载体调控的耻垢分枝杆菌生长曲线;应用制备的多克隆抗体验证所构建的下调表达模型;观察sm-ddla基因下调表达对细菌生长及形态的影响,为阐明特异性的ddla抑制剂的作用机制提供理论参考。本文所获得的实验结果:1.构建了pcold-tb-ddla表达载体及ddla在大肠杆菌中的表达体系;提取、纯化tb-ddla蛋白,并鉴定其d-丙氨酰-d-丙氨酸连接酶酶活性;建立了应用d-氨基酸氧化酶体系对酶活性进行分析的elisa方法,并确定了最适反应条件为:底物丙氨酸的浓度10mmol/ml,缓冲液为含有5mmol/mlatp的100mmhepes(ph8.0)37℃保温1h;制备抗tb-ddla蛋白的多克隆抗体,并用酶联免疫吸附试验以及免疫印迹法证实了所获得的抗体具有高效价性与特异性。2.构建了sm-ddla反义表达载体pmind-sm-ddla-as及耻垢分枝杆菌sm-ddla反义rna下调表达模型,以强力霉素诱导pmind-sm-ddla-as在耻垢分枝杆菌中的表达,生长曲线结果表明最佳的诱导条件为:强力霉素浓度,20ng/ml;培养时间,36h左右。本研究中以pmindinsmeg的耻垢分枝杆菌菌株作为对照进行研究3.提取耻垢分枝杆菌pmind-sm-ddla-as反义下调表达菌株在20ng/ml强力霉素诱导生长36h时细菌总蛋白,以制备的抗ddla多克隆抗体检测细菌中ddla蛋白的表达,westernblot结果显示在反义下调表达菌株中ddla蛋白呈下调表达。透射电子显微镜对pmind-sm-ddla-as反义下调表达菌株的形态观察结果表明:ddla蛋白下调表达后细菌的形状变长,胞内物质密度不均一。本研究中以pmindinsmeg的耻垢分枝杆菌菌株作为对照。未来的研究方向:1.以建立的DdlA酶促反应体系筛选能特异地作用于M.Tb DdlA的化合物。2.通过制备型HPLC提取、分离并纯化ddlA基因反义下调表达的耻垢分枝杆菌的肽聚糖,将提取的肽聚糖与RAW264.7巨噬细胞共培养,观察D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶缺陷的耻垢分枝杆菌细胞壁对细胞感染的可能影响。本实验将以pMind in Smeg的耻垢分枝杆菌菌株细胞壁作为对照。3.检测反义下调菌株对一二线抗结核药物的敏感性4.基于本课题的结果制备大量sRNA,并利用虚拟筛选寻找抗结核药物。