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背景： 肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一种常见的恶性肿瘤，目前在全球癌症死亡原因中居第二位，严重危害人民健康。HCC通常发生于慢性肝炎的基础上，流行病学研究表明，乙肝病毒（HBV）或丙肝病毒（HCV）的慢性感染、酗酒、胰岛素抵抗和遗传性代谢病等是 HCC的主要危险因素。临床资料表明，肝硬化患者进行门腔分流术后，与保守治疗相比肝癌发生率增高。而 TIPS术后部分未经肝脏解毒的血液直接进入体循环，可致血氨增高。由此我们推测高氨可能是HCC的发生或促进因素。 缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是 HIF-1的一个亚基，决定HIF-1的活性。HIF-1是Semenza于1992年发现的，普遍表达于肿瘤组织，在肿瘤的发展进程中发挥作用。大多数正常细胞的能量来源为线粒体氧化磷酸化，而肿瘤细胞即使在氧充足的情况下，能量来源也更多地依赖于糖酵解，这种现象称为 Warburg效应。HIF-1α在此促进肿瘤生长的代谢改变中发挥着重要作用。有研究表明在肝癌中，HIF-1α可以上调VEGF、cyclinD1、TGF-β、IGF-2等生长因子，促进肝癌细胞的增殖分化，完成细胞周期进程。 HIF-1α一个重要的下游基因是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGF及其受体直接或间接地促进肿瘤血管生成，在多种肿瘤细胞中高表达。VEGF特异性结合在内皮细胞上的血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）上，进而启动PI3K/AKT、PLC－IP3/DAG－PKC、Shc/RAS/MAPK及FAK/paxillin等多条信号传导通路，诱导细胞的分裂、增殖和迁移，改变细胞相关基因的表达来降解基质，达到促进肿瘤新生血管形成的结果[8]。VEGF是目前已知的唯一只起促进新生血管生成的细胞因子。HIF-1α基因是肿瘤代谢转变的重要基因，由此我们推测高氨可能诱导HIF-1α及其下游基因VEGF高表达，促进肝癌的发生。 因此本实验模拟人体肝硬化患者体内高氨环境，用不同浓度 NH4Cl处理Changliver原代肝细胞并进行反复传代，观察 HIF-1α及其下游基因 VEGF的表达。 目的： 探索不同浓度NH4Cl（0、1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L）处理对人正常肝细胞Changliver细胞缺氧诱导因子HIF-1α及其下游VEGF基因mRNA和蛋白表达的影响。 方法： 人正常肝脏细胞（human beings liver cell strain;Changliver)以37℃5％CO2培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，对照组正常培养，实验组分别以含1.25、2.5和5mmol/L NH4Cl的培养基培养，正常传代；分别在传至5、10、15代时，收集对数生长期的细胞各1×107，铺板，提取细胞总 RNA和总蛋白，RNA用nanodrpo超微量分光光度计测量浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，蛋白用bradford法定量。制备细胞爬片：细胞在铺有灭菌玻璃片的六孔板长满后，用4%多聚甲醛固定。实时荧光定量 PCR（RT-PCR）检测三组样本HIF-1α及VEGF mRNA表达，免疫组化DAB染色法检测三组样本HIF-1α及VEGF蛋白表达，蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测三组样本 HIF-1α及 VEGF蛋白表达。应用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以α=0.05为检验水准。 结果 1、HIF-1α实时荧光定量 PCR检测结果：相同传代数的细胞，实验组和对照组相比，实验组 HIF-1α mRNA表达量均明显高于对照组（5代、10代和15代组内比较 F值分别为：90976.659，1300.218，1896.800，P<0.05），5mmol/L氯化铵处理后 mRNA表达量略低于1.25mmol/L和2.5mmol/L组，但较对照组高。5、10、15代时的细胞HIF-1αmRNA表达量实验组均高于对照组。 2、HIF-1α免疫组化DAB染色法检测结果：相同传代数的细胞，实验组和对照组相比，实验组 HIF-1α蛋白表达量均明显高于对照组（5代、10代和15代组内比较 F值分别为：376.709，1615.358，1350.120，P<0.05），1.25mmol/L和2.5mmol/L组氯化铵处理后蛋白表达量略低于5mmol/L组，但较对照组高。5、10、15代时的细胞HIF-1α蛋白表达量实验组均高于对照组。 3、HIF-1α蛋白免疫印迹实验检测结果：相同传代数的细胞，实验组和对照组相比，实验组 HIF-1α蛋白表达量均明显高于对照组（5代、10代和15代组内比较F值分别为：228.499，6051.974，183.219，P<0.05）。5、10、15代时的细胞HIF-1α蛋白表达量实验组均高于对照组。 4、VEGF实时荧光定量 PCR检测结果：相同传代数的细胞，实验组和对照组相比，实验组 VEGF mRNA表达量均明显高于对照组（5代、10代和15代组内比较 F值分别为：3554.143，2381.321，2591.954，P<0.05），5mmol/L氯化铵处理后 mRNA表达量略低于1.25mmol/L和2.5mmol/L组，但较对照组高。5、10、15代时的细胞VEGF mRNA表达量实验组均高于对照组。 5、VEGF免疫组化 DAB染色法检测结果：相同传代数的细胞，实验组和对照组相比，实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组（5代、10代和15代组内比较F值分别为：904.789，5105.186，8644.498，P<0.05），1.25mmol/L和2.5mmol/L组氯化铵处理后蛋白表达量略低于5mmol/L组。5、10、15代时的细胞VEGF蛋白表达量实验组均高于对照组。 6、VEGF蛋白免疫印迹实验检测结果：相同传代数的细胞，实验组和对照组相比，实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组（5代、10代和15代组内比较 F值分别为：5549.429，40187.665，120982.183，P<0.05）。5、10、15代时的细胞VEGF蛋白表达量实验组均高于对照组。 结论： NH4Cl促进了Changliver细胞HIF-1α及其下游基因VEGF的表达，改变肝细胞生长过程中的微环境，促进细胞增殖，可能参与肝细胞的癌变过程。