神经-内分泌-免疫网络在维持机体内环境及生理功能平衡和稳定过程中具有重要作用。神经递质、神经肽、激素等可通过与免疫细胞上相应的受体结合发挥免疫调节功能。神经肽P物质(SP)是发现最早的神经肽之一，广泛分布于中枢和周围神经系统及组织器官。SP不仅是一种重要的神经递质，而且还是神经系统、内分泌系统和免疫系统共同的调节因子，是传递信息、调节机体反应的重要信使。SP的功能主要通过NK-1R介导，NK-1R在NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突状细胞等均有表达。　　 NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，杀伤靶细胞不需抗原预先致敏，无MHC限制性，其功能的发挥主要依赖于其识别靶细胞的受体。NK细胞能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫，是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。　　 目前，有关SP对NK细胞生物学功能的调控研究，国内外报道较少。已有一些研究（包括本课题组的研究）表明SP对NK细胞有调节作用，但其作用机制尚不十分清楚，特别是SP活化NK细胞的信号通路未见报道，其活化过程中变化的蛋白分子也报道较少。　　 蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的科学，可对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体进行研究。通过比较分析不同条件下蛋白质组的差异表达，来发现和鉴定出有差异的蛋白质或蛋白质群。因此，蛋白质组学技术的发展为全面研究细胞蛋白质变化提供了条件。　　 NK-1R属G-蛋白偶联受体家族，受体激活后通过G-蛋白调节第二信使的形成。我们采用Real-time PCR和流式细胞术分别测定了SP对NK-1R基因表达和膜受体表达的影响，结果显示SP可诱导NK-1R的表达明显增高，说明SP通过增加NK-1R的表达来放大其对NK92-MI细胞的各种调节作用，提示SP对NK92-MI细胞的各种调节作用应为SP激活NK-1R后的下游事件。因此有必要进一步研究SP对与G蛋白影响。　　 G蛋白属外周蛋白，它们在膜的细胞质面通过脂肪酸链锚定在质膜上。G蛋白由α、β、γ三个亚基组成，Gα亚基在信号传递过程中发挥主导作用。G蛋白是一个大家族，分为Gs，Gi/o，Gq/11和G124个家族。依细胞类型的不同，SP可通过不同的G蛋白产生不同的第二信使而发挥作用。　　 根据对腺苷酸环化酶(AC)的作用，G蛋白可分为刺激性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)。Gs的主要作用是激活AC和钙离子通道，Gi的主要作用是抑制AC和激活钾离子通道。细胞内cAMP的产量与AC的活性密切相关，AC被激活后促进cAMP的合成。cAMP作为第二信使激活依赖cAMP的蛋白激酶A(PKA)实现信号传导功能，参与细胞代谢过程的调节。cAMP-PKA信号通路是否参与SP活化NK细胞的过程尚无报道。　　 本研究制备了SP活化的NK92-MI细胞和对照组细胞总蛋白的双向凝胶图谱，应用PDQuest软件对双向凝胶电泳图谱进行比较分析，找出差异表达的蛋白质点，再采用MALDI-TOF-MS质谱分析对差异表达的蛋白质进行鉴定，搜索数据库鉴定全部差异表达的蛋白质。拟获得SP激活NK92-MI细胞前后的差异表达蛋白谱。　　 通过QRT-PCR和westernblot技术分别检测SP对NK92-MI细胞Gαs和Gαi3mRNA和蛋白表达的影响。采用Gs特异性拮抗剂NF449分析Gs在SP调节NK92-MI细胞功能中的作用。通过检测NF449对SP活化NK92-MI细胞活性及相关分子的影响来探讨SP调控NK92-MI细胞的信号传导途径，从而阐明SP调控NK细胞功能的分子机制。　　 材料和方法：　　 1.细胞培养　　 NK细胞株:NK92-MI细胞株用含12.5％胎牛血清和12.5％马血清的α-MEM培养基传代培养。　　 2.SP活化NK细胞的蛋白质组学分析　　 制备了SP活化的NK92-MI细胞和对照组细胞总蛋白的双向凝胶图谱，应用PDQuest软件对双向凝胶电泳图谱进行比较分析，找出差异表达的蛋白质点，再采用MALDI-TOF-MS质谱分析对差异表达的蛋白质进行鉴定，搜索数据库鉴定全部差异表达的蛋白质。　　 3.SP对NK92-MI细胞Gαs和Gαi3表达的影响　　 通过QRT-PCR和western blot技术分别检测SP对NK92-MI细胞Gαs和Gαi3mRNA和蛋白表达的影响。　　 4.NF449对SP活化的NK92-MI细胞杀伤活性、增殖活性的影响　　 NF449预处理组NK92-MI细胞用Gs拮抗剂NF449预先作用30min，无NF449预处理组用相同体积PBS作用，再以浓度为10-12 M的SP作用24h（杀伤试验）或48h（增殖试验），用CCK-8试剂盒检测NF449对SP活化的NK细胞杀伤活性和增殖活性的影响。　　 5.NF449对SP活化的NK92-MI细胞与杀伤活性相关的蛋白和基因表达的影响NF449预处理组NK92-MI细胞用Gs拮抗剂NF449预先作用30min，无NF449预处理组用相同体积PBS作用，再以浓度为10-12M的SP作用24h。提取细胞总蛋白和RNA，分别用Real-Time PCR和Western-Blot技术检测NF449对SP活化的NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B mRNA和蛋白表达的影响;用Real-Time PCR检测NF449对SP活化的NK92-MI细胞IFN-γ mRNA表达的影响;分别用Real-Time PCR和流式细胞技术检测NF449对SP活化的NK92-MI细胞NKp46、NKp44、NKp30 mRNA及膜受体的表达的影响。　　 6.统计学分析　　 所得实验数据均以均数±标准差（x±SD）表示，各组间均数比较采用一维方差分析(one-way ANOVA)，p＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1.通过双向电泳结合质谱技术和生物信息学手段分析了SP活化的NK92-MI细胞和对照组细胞的蛋白质差异，共找出40个差异蛋白点，鉴定出Rho GDI等21种蛋白质。通过GO进行功能分类，这些蛋白具有抗凋亡、参与免疫应答、参与应激反应、细胞周期、调节细胞生长和参与信号传导等功能。　　 2.浓度为10-12、10-10M的SP均可促进NK92-MI细胞Gαs和Gαi3 mRNA表达，与对照组比较有明显差异。浓度为10-14、10-12、10-10M的SP均可促进NK92-MI细胞Gαs蛋白表达，与对照组比较有明显差异;浓度为10-12、10-10M的SP对Gαi3的表达有促进作用，与对照组比较有明显差异。　　 3.结果显示浓度为10-12M的SP能够促进无NF449预处理组细胞杀伤活性，但对NF449预处理组细胞则无明显促进杀伤活性作用。且在此浓度SP作用下，无NF449预处理组细胞杀伤活性明显高于NF449预处理组细胞。这表明NF449对SP的促杀伤活性具有阻断作用。　　 4.浓度为10-12M的SP对无NF449预处理组和NF449预处理组细胞均有促进增殖活性作用;在此浓度的SP作用下，两组细胞的增殖活性无明显差异。结果表明，NF449对SP的促增殖活性无明显影响。　　 5.浓度为10-12M的SP能够明显促进NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶mRNA和蛋白表达水平，但NF449对这种促进作用有明显的阻断作用。进而表明SP可通过促进Gs的表达促进穿孔素和颗粒酶的表达，从而促进NK92-MI细胞的杀伤活性。　　 6.浓度为10-12M的SP对无NF449预处理组NK92-MI细胞IFN-γ mRNA的表达有促进作用，但对NF449预处理组NK92-MI细胞IFN-γ mRNA的表达无明显促进作用。结果表明SP可通过促进Gs的表达上调IFN-γ mRNA的表达，这也可能与SP促进NK92-MI细胞的杀伤活性有关。　　 7.浓度为10-12 M的SP对无NF449预处理组和NF449预处理组NK92-MI细胞NKp44、NKp30 mRNA的表达均有促进作用。流式细胞检测结果显示浓度为10-12M的SP对无NF449预处理组NK92-MI细胞NKp44的表达有促进作用，但对NF449预处理组NK92-MI细胞无明显促进作用，在此浓度的SP作用下，无NF449预处理组细胞NKp44的表达水平明显高于NF449顸处理组细胞;浓度为10-12M的SP对无NF449预处理组和NF449预处理组NK92-MI细胞的NKp30表达均无明显影响。结果表明NF449对SP促进NKp44表达的活性具有一定的阻断作用，也进一步表明NF449对SP活化NK92-MI细胞杀伤活性的阻断作用与NF449对NKp44表达的阻断作用有关。　　 结论：　　 1.Rho GDI蛋白可能与SP活化NK92-MI细胞的信号传导过程有关。　　 2.SP可促进NK92-MI细胞Gαs和Gαi3 mRNA及蛋白的表达，表明SP对cAMP-PKA通路有调控作用　　 3.NF449对SP的促杀伤活性具有一定的抑制作用;NF449对SP的促增殖活性无明显影响。表明SP可通过促进Gs表达促进NK92-MI细胞杀伤活性。　　 4.NF449对SP促进穿孔素、颗粒酶、NKp44分子表达的活性具有一定的阻断作用。表明SP可通过促进Gs表达促进穿孔素、颗粒酶、NKp44的表达，从而促进NK92-MI细胞的杀伤活性。　　 5.NF449对SP促进IFN-γ mRNA表达的活性具有一定的阻断作用。表明SP可通过促进Gs表达促进IFN-γ mRNA的表达。