研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以糖代谢紊乱为主的一种内分泌常见病,糖尿病患病率和糖尿病患者人数正在快速增长。国际糖尿病联盟(the International Diabetes Federation,IDF)评估,至2040年,成年人糖尿病患者(20-79岁),每10个人中就有1人确诊糖尿病,2045年,全世界将有6.29亿糖尿病患者,糖尿病的死亡率将大于艾滋病、结核病和疟疾死亡率的总和,每年约有500万人死于糖尿病,大约每6秒就有1个糖尿病患者死亡。据统计预测,预计至2040年全球糖尿病医疗保健支出总额增长至8020亿美元,《中国2型糖尿病指南》中指出:中国成人糖尿病患病率在10.9%,发病趋于年轻化,40岁以下患病率高达5.9%,并且未诊断糖尿病比例较高。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是一种较常见的糖尿病微血管并发症之一,在我国,视网膜病变在糖尿病患者人群中患病率为24.7%-37.5%,病程在10-15年的糖尿病患者,糖尿病视网膜病变的患病率为50%～70%,约有2%的糖尿病患者发病15年后因糖尿病视网膜病变而完全失明,糖尿病视网膜病变是20至74岁之间视力丧失的主要原因,但我国真正得到早期诊断的糖尿病视网膜病变患者比例不到20%,糖尿病视网膜病变的发生发展在很大程度上影响了人们的生活,更影响了人们的生存质量。糖尿病病程、血糖水平、血压、血脂等临床因素对糖尿病视网膜病变的发生发展有一定的影响。但糖尿病视网膜病变在发病的病程、严重程度上存在很大的个体差异,一些糖尿病病程长的患者尽管血糖控制不严但仍未发生糖尿病视网膜病变,而还有一些患者迅速发生糖尿病视网膜病变,这种差异性有可能是由于基因多态性造成的。近年来,人们对基因传递载体的安全性和生物分布的了解增多,已经有研究证明,干细胞和基因治疗可以逆转退行性视网膜病变。药物涉及萎缩性或受损视网膜组织再生、神经营养因子、免疫调节,置换突变基因的新疗法。随着科技进步,可选择干预的基因数目也逐渐增多,当前针对糖尿病视网膜病变的基因治疗研究较多的是用相关基因药物对抗色素上皮衍生因子、血管抑素、内皮抑素、血管内皮生长因子,抑制内皮细胞增生和形成新生血管,达到防治糖尿病视网膜病变的临床目的。目前糖尿病视网膜病变的发病机制及相关基因仍有待深入挖掘,课题组前期研究表明,通过与正常人基因数据对比,糖尿病视网膜患者DNA检测出现9个相同的差异位点,认为糖尿病视网膜病变与其有关,待进一步验证。中医药治疗消渴病已有千年历史,在中医学中,消渴病与糖尿病最为接近,现代医学中常将二者等同。DR属于消渴病变症,多数医家称DR为“消渴目病”,归属于“雀目”“内障”“暴盲”“视瞻昏渺”“云雾移睛”等范畴。肝肾虚损、心脾亏虚致目窍失养。经过大量临床实践证明,中医药在防治糖尿病视网膜病变中有显著疗效,但同时面临着因成分过于复杂、作用机制不明确,致使关于中药复方的理论研究进度相对缓慢,而且运用传统药理实验方法很难达到预设的目标。随着系统生物学的逐渐完善,在此基础上的网络药理学结合计算机技术的蓬勃发展,出现多学科交叉的研究方法,并且已逐步应用在中医领域,这些新兴科学技术的出现,为探索糖尿病视网膜病变的理论、临床研究、药物研发等提供了新的方法策略。网络药理学的研究模式也由以往“单药物、单靶点”向“疾病-基因-靶点-药物”转变,对生物系统网络进行整体分析,分析、模拟、预测药物的药理作用机制,检验、评估药物临床治疗效果、毒副反应等,有助于中药复方活性物质、配伍规律和多途径系统调控机制的研究和多分子、多靶点中药新药的研发。研究目的:1采用质谱的高级分析方法验证前期研究筛选出的糖尿病视网膜病变的9个差异位点,探索糖尿病视网膜病变患者DNA中特异性高表达基因位点并分析其生物学机制。2利用网络药理学方法分析糖网方(仝小林教授经验方)治疗糖尿病视网膜病变的药物-靶点-疾病关系,佐证高表达基因生物学机制。研究方法:1随机在门诊采集40例确诊为糖尿病视网膜病变患者的全血样本并进行样本质量检测,通过质量检测后,以前期研究筛查出的9个SNP差异位点为切入点,拟采用MassARRAY核酸质谱分析技术,验证特异性高表达基因位点,通过六个数据库NCBI数据库;ENSEMBL数据库;UCSC数据库;POLYSEARCH2数据库;lncRNASNP数据库;HGNC数据库查询差异位点所处基因,通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库查找并分析相关的代谢通路(P<0.01)。2通过三个中药化学成分数据库TCMSP、TCM Database、TCMID,查找糖网方中的药物成分的化学成分,在OMIM数据库中查找糖尿病视网膜病变的对应靶点。运用软件Cytoscape构建糖网方有效成分-靶标相互作用网络;通过人类孟德尔遗传数据库OMIM以及GAD数据库,找到糖尿病视网膜病变基因数据,以及相关靶点,利用软件Cytoscape构建药物-靶点-疾病作用网络;利用软件STRING构建,药物-疾病之间的PPI网络,对筛选出的靶点进行GO富集分析,并在KEGG数据库中进行代谢通路筛查,分析糖网方治疗糖尿病视网膜病变的作用机制。研究结果:1研究随机纳入40例确诊为糖尿病视网膜病变患者,采集的全血标本质量为39例A类,1例B类,标本浓度、纯度、完整性均满足实验要求,在满足实验次数上有所区别。进行MassARRAY核酸质谱分析,验证9个基因位点,分别为rs9345283、rs11175883、rs738322、rs1727638、rs12505641、rs12142968、rs1 1243897、rs2844795、rs16984239,验证检出率均为100%,通过基因位点数据库查询到rs738322位点位于PLA2G6基因、CDK-6基因、PARP1基因和APEX1基因;rs11243897位点位于AK8基因;rs2844795位点位于TRIM31基因;rs16984239位点位于KCNS3基因和RDH14基因;rs12505641位点位于LOC105374524基因;rs1727638 位点位于 LINC01626 基因,rs9345283 位点、rs12142968 位点及rs1 1175883位点未找到所在基因。通过KEGG数据库分析代谢通路,发现PLA2G6参与TRP通道的炎症介质调节、甘油磷脂代谢、醚脂代谢、花生四烯酸代谢、α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢、血管平滑肌收缩、RAS信号通路、FcyR介导的吞噬作用,与炎症介质调节、脂质代谢、收缩血管平滑肌、调节细胞自噬、细胞吞噬作用有关;PARP1参与NF-kB信号通路、程序性细胞死亡,与细胞凋亡、自吞噬性程序性细胞死亡、Paraptosis、细胞有丝分裂灾难、细胞胀亡,还与炎症反应、免疫应答有关;APEX1参与碱基切除修复,与细胞增殖、分化和细胞凋亡等细胞反应有关。2通过设置OB≥30%,DL≥0.18进行数据库查找、筛选,经筛选有88种成分的根据找到对应靶点的成分后,黄芪包含20种,桂枝包含7种,枸杞子包含45种,谷精草包含8种,蒲黄包含8种。找到262个对应的靶点蛋白,将筛选出的糖网方中的中药化学成分与靶点蛋白按相互作用对应,导入软件Cytoscape中进行数据分析。构建的糖网方中药化学成分与对应靶点的PPI网络显示存在1958个节点,3916条边。通过OMIM,GAD数据库中找到糖尿病视网膜病变共2184种,根据糖网方中药化学成分、疾病直接靶点的相互作用关系。根据88个成分和所对应的疾病靶点,进行富集分析得到,147个GO生物学过程,152个KEGG生物通路。3通过高表达的差异基因位点对应的代谢通路与糖网方干预糖尿病视网膜病变的有关代谢通路的结果进行比对,发现共同的代谢通路有四个,分别为:NF-kB信号通路(NF-kappa B signaling pathway);RAS信号通路(Ras signaling pathway);Fcγ R 介导的吞噬 作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis);细胞凋亡(Apoptosis)。结论:1考虑PLA2G6基因通过炎症介质调节、脂质代谢、收缩血管平滑肌、调节细胞反应参与DR发生发展;PARP1基因通过细胞反应、炎症反应及免疫应答参与DR发生发展;APEX1基因通过细胞反应有关参与DR发生发展。2对糖网方干预糖尿病视网膜病变进行网络药理学方法分析,推测糖网方可能通过抑制神经系统中JNK信号通路的激活,抑制TNF-α诱导的炎症反应,调节血管内皮因子水平,抑制细胞凋亡,改善微循环,起到多靶点的干预效应。利用网络药理学分析中药复方的作用机制的可信度与各个药物及基因数据库的数据完善程度有关,且本研究的结果还需要临床试验与动物实验进一步验证。