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背景和目的：结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球第二常见癌症相关死亡的恶性肿瘤，尽管CRC患者经过系统治疗生存率得到一定改善，但转移性CRC患者常常因为肿瘤复发和转移预后不良。免疫治疗已成为新兴的肿瘤治疗策略之一，但是缺乏理想的动物模型一直是限制转移性CRC免疫研究进展的重要原因。因此，本研究拟构建模拟人散发性CRC合并肝转移的基因工程小鼠模型，为CRC发生进展和转移的免疫研究提供一个合适的动物模型。
方法：将购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的C57BL/6-Apctm1Tyj/J(Apcloxp)Smad4tm2.1Cxd/J(Smad4loxp)小鼠分别与本地的C57BL/6J小鼠杂交，交换遗传背景后使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光定量PCR鉴别小鼠及其子代基因型，筛选出基因型为Apcloxp/loxp、KrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp小鼠，再将Apcloxp/loxp、KrasLSL-G12D/-、Smad4loxp/loxp小鼠之间多次杂交，最终筛选出基因型为Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-的双转基因和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp三转基因小鼠。将前期构建好的病毒质粒pHIV-UbiPuromycin-Cre-IRES-Luciferase通过CaCl2法转染293T细胞，收集病毒上清液并纯化得到表达Cre重组酶(cyclization recombination enzyme, Cre)和Luciferase的慢病毒颗粒(记为lentivirusCre-IRES-Luciferase)，测定病毒滴度。将小鼠分为Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp三组，每组小鼠各30只，在小鼠结肠镜下向小鼠肠黏膜下注射lentivirusCre-IRES-Luciferase，3周末体外检测小鼠灌肠液中Cre重组酶的活性，每4周行小鼠行结肠镜和小动物活体显像(in vivo imaging system, IVIS)，记录小鼠肿瘤大小、成瘤率以及肝转移情况。至24周末将小鼠安乐死，解剖小鼠观察肿瘤大体形态，取小鼠肿瘤灶及转移病灶组织行苏木精一伊红(Hematoxylin-Elaeagnus，HE)染色观察其病理改变情况。采用Graphpadprism7软件进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：成功培育出基因型为Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp的基因工程小鼠；lentivirusCre-IRES-Luciferase成功感染了Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp小鼠结肠隐窝功能干细胞，模型小鼠特定基因发生突变而引起CRC的发生、发展和转移；经过结肠镜和IVIS显像以及解剖后的肿瘤大体形态学观察，组织病理学鉴定证实为小鼠CRC腺瘤、腺癌和肝转移。Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp三组小鼠肿瘤发生率分别为36.7%(11/30)、50.0%(15/30)、53.3%(16/30)，差异无统计学意义(P＞0.05)，肿瘤大小分别为(2.6±0.4)、(3.4±0.6)、(3.6±0.5)mm，差异有统计学意义(P＜0.05)，肝转移率分别为0.0%(0/11)、6.7%(1/15)、43.8%(7/16)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论：本研究构建的基因工程小鼠模型通过特异性突变小鼠结肠上皮细胞，形成与人体CRC类似的散发性癌灶，同时转入观察标记，可对肿瘤发生、发展和转移过程行无损伤性活体观察；成功构建了能模拟人体散发性CRC合并肝转移的小鼠模型，且病理变化遵循人类CRC的腺瘤-腺癌-转移的轴向发展规律，肿瘤的发生和转移更接近CRC的自然发生状态，可对原发癌灶反复取材，适合CRC发生发展和转移的局部免疫研究。
方法：将购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的C57BL/6-Apctm1Tyj/J(Apcloxp)Smad4tm2.1Cxd/J(Smad4loxp)小鼠分别与本地的C57BL/6J小鼠杂交，交换遗传背景后使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光定量PCR鉴别小鼠及其子代基因型，筛选出基因型为Apcloxp/loxp、KrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp小鼠，再将Apcloxp/loxp、KrasLSL-G12D/-、Smad4loxp/loxp小鼠之间多次杂交，最终筛选出基因型为Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-的双转基因和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp三转基因小鼠。将前期构建好的病毒质粒pHIV-UbiPuromycin-Cre-IRES-Luciferase通过CaCl2法转染293T细胞，收集病毒上清液并纯化得到表达Cre重组酶(cyclization recombination enzyme, Cre)和Luciferase的慢病毒颗粒(记为lentivirusCre-IRES-Luciferase)，测定病毒滴度。将小鼠分为Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp三组，每组小鼠各30只，在小鼠结肠镜下向小鼠肠黏膜下注射lentivirusCre-IRES-Luciferase，3周末体外检测小鼠灌肠液中Cre重组酶的活性，每4周行小鼠行结肠镜和小动物活体显像(in vivo imaging system, IVIS)，记录小鼠肿瘤大小、成瘤率以及肝转移情况。至24周末将小鼠安乐死，解剖小鼠观察肿瘤大体形态，取小鼠肿瘤灶及转移病灶组织行苏木精一伊红(Hematoxylin-Elaeagnus，HE)染色观察其病理改变情况。采用Graphpadprism7软件进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：成功培育出基因型为Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp的基因工程小鼠；lentivirusCre-IRES-Luciferase成功感染了Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp小鼠结肠隐窝功能干细胞，模型小鼠特定基因发生突变而引起CRC的发生、发展和转移；经过结肠镜和IVIS显像以及解剖后的肿瘤大体形态学观察，组织病理学鉴定证实为小鼠CRC腺瘤、腺癌和肝转移。Apcloxp/loxp、Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-和Apcloxp/loxpKrasLSL-G12D/-Smad4loxp/loxp三组小鼠肿瘤发生率分别为36.7%(11/30)、50.0%(15/30)、53.3%(16/30)，差异无统计学意义(P＞0.05)，肿瘤大小分别为(2.6±0.4)、(3.4±0.6)、(3.6±0.5)mm，差异有统计学意义(P＜0.05)，肝转移率分别为0.0%(0/11)、6.7%(1/15)、43.8%(7/16)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论：本研究构建的基因工程小鼠模型通过特异性突变小鼠结肠上皮细胞，形成与人体CRC类似的散发性癌灶，同时转入观察标记，可对肿瘤发生、发展和转移过程行无损伤性活体观察；成功构建了能模拟人体散发性CRC合并肝转移的小鼠模型，且病理变化遵循人类CRC的腺瘤-腺癌-转移的轴向发展规律，肿瘤的发生和转移更接近CRC的自然发生状态，可对原发癌灶反复取材，适合CRC发生发展和转移的局部免疫研究。