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研究背景急性髓系白血病（AML）是一类起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,是成人最常见的血液系统恶性肿瘤,其中大约20%-30%的AML伴有FLT3-ITD突变,伴有FLT3-ITD突变的AML患者预后不良。FLT3受体可以与其配体结合激活下游信号通路,引起细胞增殖失控、凋亡受阻及化疗敏感性下降,也是FLT3-ITD阳性AML患者难治复发的重要原因。目前AML的治疗方案以传统化疗为主,高危患者缓解及巩固治疗后尽早行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗。近年研究发现,传统化疗方案治疗FLT3-ITD阳性AML患者总生存（OS）及无复发生存期（RFS）短,联合FLT3抑制剂疗效仍有限。Allo-HSCT本身也不能使FLT3-ITD阳性AML患者长期获益,allo-HSCT后FLT3抑制剂的维持治疗可以明显降低FLT3-ITD阳性AML患者复发风险。因此,FLT3-ITD阳性AML患者的耐药机制,联合分子靶向药物提高疗效是目前研究的热点和难点。FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是一种第三类受体酪氨酸激酶,在造血调控和淋巴细胞增殖中发挥重要作用,FLT3的异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关。有研究发现,FLT3信号不仅参与AML的发病机制,也可以介导AML细胞对化疗药物如阿糖胞苷耐药。临床研究表明,索拉非尼（Sorafenib）联合化疗可以提高FLT3-ITD阳性AML的无事件生存（EFS）及RFS,但对OS改善不明显。因此,联合靶向药物治疗FLT3-ITD阳性AML患者,对提高患者疗效及改善预后有重要的临床价值。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）抑制剂,可以抑制组蛋白去乙酰化酶功能,提高组蛋白乙酰化水平,通过表观遗传学调控多种基因及蛋白水平,影响细胞增殖与凋亡。研究证实,HDAC抑制剂具有抑制肿瘤细胞迁移和抗血管生成,从而抑制肿瘤细胞生长,HDAC抑制剂已成为治疗实体肿瘤及淋巴瘤领域的研究热点。西达本胺是我国自主研发的新型HDAC抑制剂,被FDA批准用于治疗复发或难治的外周T细胞淋巴瘤（PTCL）患者。西达本胺的主要靶点是肿瘤发生和发展高度相关的第I大类HDAC中1、2、3亚型和第IIb类的10亚型,通过抑制特定的HDAC亚型,发挥染色质重构与基因转录调控作用,从而抑制细胞周期、诱导细胞凋亡、增强自然杀伤细胞（NK）和抗原特异性细胞毒T细胞（CTL）介导的肿瘤杀伤作用。西达本胺在FLT3-ITD阳性AML中的作用及联合FLT3抑制剂抗白血病效应,目前尚不完全清楚。本课题研究西达本胺增加索拉非尼抗FLT3-ITD阳性AML白血病效应,并探讨其分子机制,为靶向治疗奠定理论基础,为临床制定新策略提供新思路。研究目的:1.研究西达本胺联合索拉非尼抗FLT3-ITD阳性AML白血病效应。2.研究MSC共培养下西达本胺联合索拉非尼诱导FLT3-ITD 阳性AML细胞凋亡作用。3.研究西达本胺协同索拉非尼抗FLT3-ITD阳性AML白血病效应机制。研究内容及方法:1.CCK8检测西达本胺联合索拉非尼对FLT3-ITD阳性AML细胞增殖抑制,流式细胞技术检测西达本胺联合索拉非尼诱导FLT3-ITD阳性AML细胞凋亡。2.MSC共培养下,西达本胺联合索拉非尼抗FLT3-ITD阳性AML白血病效应。体外利用AML患者来源骨髓MSC与Molm13、MV4-11细胞株共培养,通过CCK8及流式检测对FI,T3-ITD阳性AML细胞增殖抑制及诱导凋亡作用。3.利用 Western blot 检测 GADPH、H3、Acety-H3、FLT3、P-FLT3、AKT、P-AKT、ERK、P-ERK、Bax/Bcl2、Bim等蛋白表达水平,探讨西达本胺增加索拉非尼抗FLT3-ITD阳性AML白血病效应机制。4.统计分析:应用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析,两组计量资料比较采用t检验,多组均数比较用单因素方差分析,P值<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.CCK8结果显示,西达本胺联合索拉非尼单药处理FLT3-ITD阳性AML细胞,随药物浓度增加FLT3-ITD阳性AML细胞的增殖抑制明显增强,呈明显的剂量依赖关系。联合组药物处理24,48,72h后细胞增殖抑制率明显高于单药组（P值分别为0.00028,0.00039,0.00036）,Calcusyn 2.0软件计算西达本胺联合索拉非尼的细胞增殖抑制率CI值均<1（24h,48h,72h）,P值<0.05,说明西达本胺联合索拉非尼中有协同抑制FLT3-ITD阳性AML细胞增殖作用。2.流式检测细胞凋亡结果显示,联合组FLT3-ITD阳性AML细胞凋亡率明显高于单药组（P值为0.00037）,在MSC共培养下联合组FLT3-ITD阳性AML细胞凋亡率也高于单药组（P值为0.00045）。但MSC共培养时细胞凋亡率较非共培养低（P=0.0008）,提示MSC共培养可诱导FLT3-ITD阳性AML细胞耐药。Calcusyn 2.0软件计算索西达本胺联合索拉非尼的诱导FLT3-ITD阳性AML细胞凋亡率CI值均<1,P值<0.05,说明西达本胺联合索拉非尼有协同诱导FLT3-ITD阳性AML细胞凋亡作用。3.Western blot检测细胞信号通路蛋白变化,结果显示,与对照组相比,索拉非尼或西达本胺单药处理FLT3-ITD阳性AML细胞24h后Bax/Bcl2、Bim无明显变化,但P-ERK、P-AKT表达受抑制,西达本胺联合索拉非尼联合处理FLT3-ITD 阳性AML细胞48h后的P-ERK、P-AKT活性明显受抑,Bax/Bcl2、Bim表达明显升高。结论:1.西达本胺联合索拉非尼有协同抗FLT3-ITD阳性AML白血病作用。2.MSC共培养下,西达本胺可以增加索拉非尼诱导的FLT3-ITD阳性AML细胞凋亡效应。3.西达本胺通过抑制FLT3-ITD阳性AML细胞P-AKT、P-ERK活性,上调Bax/Bcl2、Bim通路,从而增加索拉非尼的抗FLT3-ITD阳性AML白血病效应。