谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)作为重要的工业生产菌株,由于其显著的优点,不仅用于氨基酸等化合物的生产,还被用于外源蛋白的表达。目前已经有很多外源蛋白以C.glutamicum作为宿主成功表达的应用,但是随着研究的深入,蛋白表达产量低,可用基因编辑工具少等问题限制了C.glutamicum作为外源蛋白表达宿主的应用。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术,在C.glutamicum中构建了一套高效的基因编辑工具。同时以C.glutamicum CGMCC1.15647为出发菌株,通过分析不同溶氧状态下细胞转录组数据发掘外源蛋白表达过程中相关的靶点基因。在此基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对发掘的优化靶点(mepA,porB和clpC)进行宿主细胞改造,改造后的宿主细胞具有外源蛋白表达能力提高的特点,并成功的利用该优化后的宿主实现了N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)在C.glutamicum中的表达。最后还研究了mepA和porB影响外源蛋白表达的机理。主要研究结论分为以下四个部分。(1)CRISPR/Cas9系统在C.glutamicum中的构建。通过提供额外的同源修复模板以弥补细胞内非同源末端修复能力的不足;通过在cas9基因前加入SD序列以解决核糖体结合能力弱的问题;通过利用可被IPTG严格诱导表达的Ptac启动子严格控制Cas9蛋白的表达,降低Cas9蛋白对细胞具有毒害作用。利用CRISPR/Cas9技术在C.glutamicum中构建了一套双载体的CRISPR/Cas9系统及一套All-in-one的CRISPR/Cas9系统。研究中构建的CRISPR/Cas9可实现C.glutamicum基因组中基因的敲除、敲入和定点突变。利用不同的基因(porB、mepA、clpX和Ncg0911)以及不同的宿主(C.glutamicum ATCC 13032和C.glutamicum CGMCC 1.15647)都能证明CRISPR/Cas9系统的适用性良好。高效的CRISPR/Cas9系统为优化C.glutamicum提供了有力的基因操作工具。(2)C.glutamicum宿主优化靶点的发掘及宿主细胞的优化。通过分析不同溶氧水平下(0%、30%和50%)的转录组数据,发现了mepA和porB两个与溶氧调控相关的基因,研究基因功能的过程中敲除mepA和porB两个基因有提高外源蛋白表达量的效果,可作为宿主细胞优化的潜在靶点。同时根据文献报道鉴定了Clp蛋白酶调节亚基基因clpC也可作为宿主优化的靶点,研究中分别构建三个基因的单敲除及共敲除菌株,并利用GFP和scFv作为模式蛋白来检测外源蛋白能力的变化,结果表明在mepA,porB和clpC三基因敲除菌种中GFP和scFv表达量相比于野生型菌株都有提高的现象。上述研究结果为优化宿主细胞提供了新的方法,并成功得到一株能够更好表达外源蛋白的C.glutamicum宿主。(3)C.glutamicum中NT-proBNP蛋白最佳表达模式组合的确立及表达。通过GFP作为模式蛋白在C.glutamicum中构建了一套可以快速探究外源蛋白组成型胞内表达,诱导型胞内表达,组成型分泌表达,诱导型分泌四种表达模式组合的方法。利用该系统探究了NT-proBNP蛋白的最佳表达模式组合,结果表明NTproBNP在C.glutamicum的最佳表达模式为组成型胞内表达,同时利用mepA,porB和clpC三基因敲除菌株ΔclpCΔporBΔmepA作为表达宿主实现了NT-proBNP在C.glutamicum中的高效表达,产量达到118.8 mg/g DCW。上述探究外源蛋白最适表达模式的方法及NT-proBNP蛋白的成功表达的实例为对应用C.glutamicum作为外源蛋白表达宿主具有借鉴意义。(4)mepA和porB影响外源蛋白表达的机制的初步研究。本研究从mepA和porB对细胞生理功能的影响及对细胞内代谢调控的影响两个层面上分析了mepA和porB影响外源蛋白表达的机制。结果表明mepA和porB过表达菌株具有溶菌酶敏感性提高,NaCl耐受性降低的现象,同时mepA过表达还有细胞增长的现象,推测敲除mepA和porB基因后提高了菌体在胁迫环境下的生存能力从而提高了外源蛋白的表达。mepA敲除菌株还影响到菌体ATP的产生时间和峰值,这也是mepA基因敲除能够影响外源蛋白表达的原因。通过构建mepA、porB、mprA和phoR的敲除和过表达菌株,并通过荧光定量及转录组数据分析,得到mepA和porB都受到MprAB双组份系统的调节,MprAB双组份系统能够调控sigma因子的表达。mepA和porB之间也互相影响与双组份系统及sigma因子之间存在相互调控关系。通过对MepA和PorB生理功能及代谢调控的研究中,初步解释了mepA和porB影响外源蛋白表达的机制,为下一步更深入的研究奠定了工作基础。