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巨噬细胞是人体固有免疫效应细胞的重要组织部分,在宿主防御中起着重要作用,是体内最重要的吞噬细胞,具有吞噬病原体、抗原递呈和分泌多种细胞因子等功能。从1883年Elie Metchnikoff首次在文献中报道巨噬细胞开始,人们一直没有停止过对巨噬细胞的研究。研究发现巨噬细胞在不同环境中具有极强的可塑性和适应性。巨噬细胞的功能状态在不同的环境下呈异质性,在正常组织中,巨噬细胞处于静息或未活化状态,而巨噬细胞的活化是其发挥强大生理功能的状态。在不同的组织微环境、不同的细胞因子作用下,巨噬细胞可极化成不同的表型。Rosenstreich等发现淋巴细胞分泌因子促进巨噬细胞吞噬细菌,随后发现是淋巴细胞分泌的干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）使静止的巨噬细胞转化为具有较强抗菌和吞噬能力、分泌炎症因子的巨噬细胞,即经典激活的巨噬细胞（M1）。1989年,随着Th1和Th2细胞的发现,研究者发现Th2细胞分泌的白介素-4（Interleukin-4,IL-4）可以使静息的巨噬细胞转化为交替激活的巨噬细胞（M2）。2010年巨噬细胞极化的概念再次被修改,研究发现了M2样巨噬细胞。这些巨噬细胞包括免疫复合物诱导的M2b型巨噬细胞、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）诱导的M2c型巨噬细胞等。当前的主流观点认为巨噬细胞可分为两个功能类别:经典激活的巨噬细胞（M1）和交替激活的巨噬细胞（M2）。M1巨噬细胞也称为炎性巨噬细胞,具有较强的抗原提呈和吞噬能力,并释放许多促炎因子,如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-a,TNF-a）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）、白细胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）、一氧化氮（NO）等,参与Ⅰ型免疫应答[1]。而M2型巨噬细胞又称为抗炎性巨噬细胞,能产生IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、精氨酸酶1（Argininase 1,Arg-1）等抗炎因子,参与Ⅱ型免疫应答,在对寄生虫、组织重塑、血管生成和过敏性反应中起着核心作用[1]。不同的体内环境因素可以触发巨噬细胞表型和功能的转换,使其在不同的刺激下发挥不同的作用,并在M1和M2表型的两个极端之间动态变化。光动力疗法（Photodynamic Therapy,PDT）是一种基于光敏剂（photosensitizer,PS）、氧、光三者相互作用对疾病进行疾病诊断和治疗的方法,PS进入人体后,选择性聚集于增殖较快细胞如肿瘤组织、感染后细胞等病变部位,在特定波长光的刺激下,生成大量氧化自由基（reactive oxygen species,ROS）,杀伤病变细胞,达到治疗目的。因其具有较好的治疗效果、不产生耐药性以及良好的美容效果,PDT越来越受到广大医生和患者的喜爱。PDT现被临床上广泛用于尖锐湿疣（condyloma acuminata,CA）、痤疮、日光性角化病（actinic keratoses,AK）、基底细胞癌（Basal cell carcinoma,BCC）、鲍恩病以及肿瘤的姑息治疗等。2007年中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）正式批准5-氨基酮戊酸-光动力疗法（5-aminolevulinic acid-photodynamic therapy,ALA-PDT）治疗CA。既往研究表明,PDT在一些条件下,具有杀伤巨噬细胞,尤其是已吞噬病毒、病原体的巨噬细胞,或在治疗部位增加巨噬细胞浸润,但PDT对巨噬细胞极化的调节作用及其机制的研究较少,而既往的研究也表明,不同PS、不同能量光照射,不同条件下,PDT作用及机制各不相同,因此,ALA-PDT对巨噬细胞的作用及其机制值得深入研究。本课题以C57小鼠、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7进行研究,探讨PDT对巨噬细胞极化状态的调节及其机制,为PDT在治疗肿瘤及感染疾病中对巨噬细胞状态的调节作用探索理论依据、提供数据支持。方法:1、利用免疫荧光技术检测ALA-PDT处理小鼠洁净伤口第0天、1天、3天时伤口周边巨噬细胞M1/M2比例。2、利用实时定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,q PCR）实验检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞后M1、M2特征标记CD86、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）、CD206、Arg-1等m RNA表达情况。3、利用免疫印迹法（western blot,WB）检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞后M1、M2特征标记CD86、i NOS、CD206、Arg-1等蛋白表达情况4、利用NF-k B激活-核转运检测试剂盒、WB实验检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞后NF-k B通路相关蛋白表达情况。5、利用WB实验检测加入NF-k B通路抑制剂后,ALA-PDT处理RAW264.7细胞NF-k B通路相关蛋白及M1特征蛋白CD86、i NOS表达情况6、利用q-PCR实验检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a等m RNA表达情况。7、利用WB实验检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a等蛋白表达情况8、利用Luminex液相悬浮芯片技术检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞后细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-a等蛋白浓度的变化情况。9、利用WB实验检测ALA-PDT处理RAW264.7细胞ERK-MAPK通路相关蛋白表达情况。10、利用WB实验检测加入ERK抑制剂后,ALA-PDT处理RAW264.7细胞ERK-MAPK通路相关蛋白、炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a等蛋白表达情况。11、利用HE染色方法检测ALA-PDT处理3天后RAW264.7细胞吞噬活性情况。结果:1、ALA-PDT作用于C57小鼠后,在第一天增高了巨噬细胞M1/M2比例,差异有统计学意义（P<0.05）,第三天时差异消失。2、ALA-PDT作用于RAW264.7细胞后,q-PCR、WB实验均显示PDT组M1特征蛋白CD86、i NOS较对照组表达明显增强,M2特征蛋白CD206、Arg-1较对照组表达明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。3、ALA-PDT作用于RAW264.7细胞后,q-PCR、WB及Luminex液相悬浮芯片技术结果均显示,PDT组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a蛋白表达增强。4、ALA-PDT作用于RAW264.7细胞3天后将细胞与白色念珠菌共培养后,观察到PDT组细胞吞噬活性较对照组明显增强,差异有统计学意义（P<0.05）。5、ALA-PDT作用于RAW264.7细胞后,NF-k B激活-核转运检测、WB实验结果显示PDT组NF-k B通路P65核内转移增强,NF-k B通路相关蛋白P-P65、NF-k B-2表达增强,通路被激活。6、加入NF-k B通路抑制剂处理后,PDT组NF-k B通路相关蛋白P-P65、NF-k B-2表达增强被抑制,M1特征蛋白CD86、i NOS表达增强被抑制。7、ALA-PDT作用于RAW264.7细胞后,WB实验结果显示PDT组ERK-MAPK通路相关蛋白p-ERK/ERK、p-P38/P38比例明显上升。8、加入ERK抑制剂后,WB结果显示ERK-MAPK通路相关蛋白p-ERK/ERK、p-P38/P38比例上升被抑制,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a等蛋白表达也被抑制。结论:1、ALA-PDT作用于C57小鼠后,可诱导局部组织内巨噬细胞向M1极化增强。2、ALA-PDT可以诱导RAW264.7细胞向M1极化,增强细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a,并增强细胞的吞噬活性。3、ALA-PDT诱导巨噬细胞向M1极化及IL-1β、IL-6、TNF-a等炎症相关蛋白分泌增强可能与ERK/MAPK信号通路相关。4、ALA-PDT诱导巨噬细胞向M1极化可能与ERK/MAPK、NF-k B信号通路相关。