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目的:通过检测不同干预方案下大鼠慢性难愈合创面组织中细胞角蛋白15(cytokeratin-15 CK15)与细胞角蛋白19(cytokeratin-19 CK19)的动态表达,探讨完善皮肤再生医疗技术(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)促进创面愈合的部分分子学机制,从而为其在临床治疗上推广应用提供理论支持。方法:将90只健康成年Wistar雄性大鼠(SPF级)随机分为空白组(18只)、急创对照组(18只)、慢创模型组(18只)、MEBO组(18只)和Rb-b FGF(18只)。其中空白组不做损伤处理,急创对照组做急性全层皮肤缺损创面模型,慢创模型组、MEBO组和Rb-b FGF组在急创对照组基础上注射氢化可的松,制备慢性难愈合创面模型。模型建立后给予创面换药,每日两次。急创对照组与慢创模型组创面给予碘伏消毒,MEBO组碘伏消毒后涂抹MEBO治疗,Rb-b FGF组碘伏消毒后涂抹重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(Recombinant bovine basic fibroblast growth factor gel Rb-b FGF)治疗。最后分别于治疗后第3,7,14天在各组中分别随机抽取6只大鼠,腹腔麻醉后,完整切取创面肉芽组织。一部分组织给予甲醛固定,之后进行HE染色。其余组织投入-80℃冰箱。所有时相点组织收集完毕后,应用Western Blotting技术以及Real Time PCR技术统一检测、对比各组大鼠创面组织中CK15、CK19蛋白表达量及CK15、CK19m RNA的转录水平。结果:(1)HE染色,各组样本HE染色后显微镜下观察,空白组未见变化,均为正常皮肤组织学形态。在造模后的第3天,急创对照组组织水肿,同时可见大量中性粒细胞浸润。慢创模型组,MEBO组,Rb-b FGF组组织间水肿,少量淋巴细胞浸润。在造模后的第7天,急创对照组镜下见中性粒细胞减少,组织间水肿减轻,少量毛细血管再生。MEBO组,Rb-b FGF组淋巴浸润情况亦有所减少,组织间水肿有所改善,除血管新生外,还可见少量毛囊。而慢创模型组淋巴细胞浸润程度未见减轻,组织水肿仍明显,缺乏新生毛细血管。在造模后的第14天,急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组组织无炎性细胞浸润,水肿不明显,可见新生的分层表皮结构,同时可见毛囊、皮脂腺等皮肤附属器。而慢创模型组仍存在淋巴细胞浸润,水肿的特征,无明显表皮及毛囊等结构。(2)Western Blotting:CK15蛋白表达结果:创面经过处理后第3,7,14天,空白组大鼠皮肤组织中CK15蛋白量表达无明显变化(P>0.05),其他各组大鼠创面组织中CK15蛋白表达量变化均较明显(P<0.05),且均呈先降低后升高的趋势,表达量均为14天>3天>7天。其中在第3天与第7天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK15蛋白表达量3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK15蛋白表达量均低于慢创模型组(P<0.05)。在第14天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK15蛋白表达量3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK15蛋白表达量均高于慢创模型组(P<0.05)。CK19蛋白表达结果:创面经过处理后第3,7,14天,空白组大鼠皮肤组织中CK19蛋白表达无明显变化(P>0.05),其他各组大鼠创面组织中CK19蛋白表达量变化均较明显(P<0.05),且均呈先升高后降低的趋势,均为表达量均为7天>3天>14天。其中在第3天与第7天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK19蛋白表达量3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK19蛋白表达量均高于慢创模型组(P<0.05)。在第14天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK19蛋白表达量3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK19蛋白表达量均低于慢创模型组(P<0.05)。(3)Real Time PCR结果:与Western Blotting结果相符。CK15m R NA转录水平结果:创面经过处理后第3,7,14天,空白组大鼠皮肤组织中C K15 m RNA转录水平无明显变化(P>0.05)。其他各组大鼠创面组织中CK15m RNA转录水平变化均较明显(P<0.05),且均呈先降低后升高的趋势,均为表达量均为14天>3天>7天。其中在第3天与第7天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK15 m RNA转录水平3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK15 m RNA转录水平均低于慢创模型组(P<0.05)。在第14天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK15 m RNA转录水平3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK15 m RNA转录水平均高于慢创模型组(P<0.05)。CK19m RNA转录水平结果:创面经过处理后第3,7,14天,空白组大鼠皮肤组织中CK19 m RNA转录水平无明显变化(P>0.05)。其他各组大鼠创面组织中CK19 m RNA转录水平变化均较明显(P<0.05),且均呈先升高后降低的趋势,均为表达量均为7天>3天>14天。其中在第3天与第7天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK19 m RNA转录水平3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK19 m RNA转录水平均高于慢创模型组(P<0.05)。在第14天时急创对照组,MEBO组,Rb-b FGF组CK19 m RNA转录水平3组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且3组CK19 m RNA转录水平均低于慢创模型组(P<0.05)。结论:(1)MEBT/MEBO可以改善创面炎症发应,减少淋巴细胞浸润,促进皮肤与其附属结构的再生。(2)MEBT/MEBO可以改变细胞外环境,调控创面肉芽组织中CK15、CK19蛋白的表达以及m RNA的转录水平,从而促进表皮干细胞的增殖与分化,加速慢性难愈合创面的修复。(3)MEBT/MEBO促进慢性难愈合创面的修复作用与Rb-b FGF相当,可在临床应用中进一步推广。