第一部分 MSC／IISC共培养体系中Hedgehog信号通路的活性 材料与方法 1.细胞来源1)激活型人HSC(由Division of Gastroenterology，Department of Medicine，Duke University Medical Center，Durham，NC，USA提供)2)人L-02肝细胞株(由Division of Gastroenterology，Department of Medicine，Duke University Medical Center,Durham，NC，USA提供)3)人MSC：采自中山大学附属第三医院临床无血液疾病志愿者髂骨内骨髓，共10例(男性6例、女性4例) 2、MSC／HSC共培养体系的建立根据孔径0.4μm的tanswellinsert半透膜仅可以通过培养液而不能透过细胞的特点，在6孔塑料培养板上架起tanswellinser半透膜，建立双层细胞共用培养液而不直接接触的培养体系。利用tanswell作为培养体系上层，接种第3代MSC：2x104cells：培养体系下层为6孔塑料培养板接种第5代的HSC：2x104 Cells。均采用置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱常规培养，培养液为含5％小牛血清L-DMEM。人L-02肝细胞为对照组 3、MSC与HSC的Hh通路相关蛋白测定 3.1 RT—PCR检测共培养体系中MSC与HSC的Hh信号传导通路蛋白(Shh、-1hh)，受体(Ptc、Smo)、转录因子(Gli 1、Gli 2、Gli 3)表达。 3.2 RT-PCR及免疫印迹法测定共培养第1天与第7天HSC的总shh mRNA 4、Hh信号通路转录因子Gli 1的表达当Hh蛋白与Hh通路受体后，可促使受体下游转录因子Gli(Glil、Gli2、Gli3)激活、启动靶基因转录，包括细胞周期调节因子和抗调亡因子等的转录。 4.1.GH 1基因表达：通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测Glil基因的表达。我们将Gli1-荧光素酶(Luciferase)报告基因载体转染MSC。在转染MSC培养皿中加入外源性重组人Shh因子，共培养24h后行荧光素酶检测Gli1基因的表达。 (1)实验分组：转染的lMSC根据是否加入外源性shh因子分为2组： ①shh／转染MSC组，培养板接种转染质粒的MSC：2x104cells，加入20um外源性shh因子； ②对照组：转染MSC以2x104cells单独培养。 (2)培养24h后测定2组细胞荧光素酶的活性，检测Glil基因的表达。 4.2 Gli1 mRNA的表达培养板接种第5代MSC 2x104 cells，加入20um外源性shh因子共培养6h，用TRlzol提取总mRNA，用RT-PCR检测Gill mRNA的表达。 5、Hh信号通路活性与MSC增殖凋亡的关系当Hh蛋白与Hh通路受体结合后，可促使受体下游的转录因子Gli(Gli1、Gli2、Gli3)激活、启动细胞周期调节因子和抗调亡因子等的转录，从而使：MSC增殖，并且凋亡活性降低。加入外源性Shh与cyclopamine(Hedgehog信号转导通路特异性抑制剂)可测定Hh通路活性与MSC增殖凋亡的关系。 5.1实验分组：根据是否加入cyclopamine(Hedgehog信号转导通路特异性抑制剂)与外源性shh，将MSC分为3组： ①对照组：单纯MSC组：96孔培养板单独接种第5代MSC 5000cells／well。 ②shh／MSC组：96孔培养板接种第5代MSC 5000cellsdwell，24h后加入20um重组人shh因子，共培养48h。 ③cyclopamine／shh／MSC组：96孔培养板接种第5代MSC 5000cells／well，加入10um cyclopamine混匀处理30min，然后加入20urn重组人shh因子共培养48h。 5.2用Brdu免疫组织化学染色分析3组MSC增殖情况的改变。 5.3凋亡蛋白(Caspase-3／7)检测：运用Apo-ONE~Homogeneous Caspase-3／7Assay试剂盒检测。分别检测shh／MSC组与单存MSC组的凋亡蛋白Caspase-3／7。 6、统计学分析 所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 10.0 for Windows软件处理，采用t检测与方差分析，P<0.05为有统计学意义二 结果 1.HSC和MSC均表达m通路相关蛋白基因shh、Ihh、受体Patched(Pte)、Smoothened(Smo)以及转录因子Gli(Gli1、Gli2、Gli3)。成熟的肝细胞不表达Hh通路蛋白mRNA。 2.RT-PCR与免疫印迹法检测：与MSC共培养7天后HSC的shh mRNA与shh蛋白含量较第1天显著升高(P<0.05)。 3.转染Gli1报告基因载体的MSC组加入外源性Shh后，荧光素酶测定提示Gli1基因表达活性较对照组明显增强(p<0.05)；RT-PCR分析提示Gli1 mRNA的定量较对照组明显升高(p<0.05)。 第二部分 Hh信号介导的HSC对MSC的调控作用 材料与方法 1、HSC对MSC增殖凋亡的影响 1.1实验分组 ①实验组：MSC／HSC共培养，孔径0.4μm的Transwell作为培养体系上层，直径6cm的塑料培养皿作为培养体系下层，HSC和MSC以2×104的量分别接种于培养皿及Transwell中。 ②对照组(MSC／MSC)： MSC以2x104的量接种于培养皿和Transwell中。 1.2 MSC增殖检测：共培养7天后，利用Brdu免疫组织化学染色分析检测各组中MSC增殖情况的改变。 1.3 MSC凋亡检测：凋亡蛋白检测(Caspase-3／7)：运用Apo-ONE(R) Homogeneous Caspase-3／7 Assay试剂盒检测。分别检测对照组B与实验组MSC的凋亡蛋白Caspase-3／7。 1.4 GLil mRNA定量分析：RT-PCR检测对照组B与实验组MSC的GLil mRNA定量。 2.Hh信号通路活性对MSC增殖与凋亡的影响 2.1实验分组 ①实验组：MSC／HSC共培养体系中加A．20ug anti-Shh中和抗体，培养24h。 ②对照组：MSC／HSC共培养体系中加入无免疫源性的IgG抗体，培养24h。 2.2 Brdu免疫组织化学染色分析：观察比较2组MSC增殖情况的改变。 3、HSC对MSC分化的影响 3.1实验分组 ①实验组：MSC／HSC共培养，孔径0.4μm的Transwell作为培养体系上层，直径6cm的塑料培养皿作为培养体系下层，HSC和MSC以2x104的量分别接种于培养皿及Transwell中。 ②阴性对照组：MSC／MSC共培养，孔径0.4／μm的Transwell作为培养体系上层，直径6cm的塑料培养皿作为培养体系下层，MSC以2x104的量分别接种于培养皿及Transwell中。 ③阳性对照组：L-02人肝细胞株。 注：两组培养基中均不加防止细胞分化的LIF。 3.2各组在共培养第7天行免疫细胞化学染色；第14天行免疫荧光染色；第7天行PT-PCR检测。 4、统计学分析 所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 10.0 for Windows软件处理，采用t检测与方差分析，P<0.05为有统计学意义。 二、结果 1.与对照组相比， MSC／HSC共培养体系中MSC的增殖明显活跃； MSC凋亡蛋白活性显著降低； MSC的GLil mRNA定量明显增加(p<0.05)。 2.与对照组相比，在MSC／HSC共培养体系加入anti-Shh中和抗体后， MSC的增殖受到明显抑制(p<0.05)。 3.MSC／HSC共培养7天后，免疫细胞化学染色提示MSC的AFP和CK18均为阳性着色。L-02人肝细胞株为阳性对照。 4.MSC／HSC共培养14天后，免疫荧光细胞化学染色提示MSC的AFP和ALB荧光染色均为阳性。 5.MSC／HSC共培养7天后，RT-PCR显示MSC分泌肝细胞特征性蛋白AFP和ALB。 结论 1.MSC／HSC共培养体系中，Hh信号通路呈高度活化状态：激活型HSC表达Hh信号通路蛋白(Shh)，MSC表达Hh信号通路受体Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)。 2.HSC通过Hh信号传导通路调控MSC的增殖、凋亡及分化：HSC分泌Hh信号蛋白与MSC的Hh受体结合，启动转录因子Gill的表达，从而促进MSC增殖，抑制MSC的凋亡活性。同时促使MSC向肝样细胞分化，分泌肝细胞特征性蛋白AFP和ALB。