结直肠癌（colorectal cancer,CRC）占全部恶性肿瘤发病率的第3位,死亡率的第2位,每年造成全球约180万的新发病例及88万的死亡病例,分别占全部恶性肿瘤发生率的10.2%,死亡率的9.2%[1]。根据最新中国癌症统计数据显示,中国结直肠癌发病率、死亡率均位于全部恶性肿瘤的第5位,其中年新发病例37.6万,年死亡病例19.1万[2]。结直肠癌的治疗目前采用的是以手术为主,放疗、化疗、靶向治疗等为辅的综合治疗,但部分中晚期结直肠癌患者预后欠佳[3]。根据遗传特点,结直肠癌可以分为遗传性结直肠癌和散发性结直肠癌（sporadic colorectal cancer,SCRC）。临床上常见的遗传性结直肠癌包括遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer,HNPCC）,即Lynch综合征,家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis,FAP）、黑斑息肉综合征（peutz-jeghers syndrome,PJS）、幼年性息肉综合征（juvenile polyposis syndrome,JPS）和锯齿状息肉病综合征（serrated polyposis syndrome,SPS）等相关的结直肠癌[4]。其中,Lynch综合征是最常见的遗传性结直肠癌,约占全部结直肠癌的2.5%-4%,90%的Lynch综合征的发生与微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）密切相关[4,5]。MSI为Lynch综合征患者带来了特有的临床病理特征、免疫微环境及预后[4-8]:（1）发病年龄较早;（2）肿瘤多位于右半结肠;（3）容易罹患同时性或异时性结直肠癌;（4）肠外恶性肿瘤发病率高,如子宫内膜癌、小肠癌、输尿管癌、胃癌、胆管癌、卵巢癌等;（5）分化程度差,粘液腺癌常见,具有丰富的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）;（6）肿瘤多呈膨胀性生长;（7）预后优于散发性结直肠癌。MSI并非Lynch综合征所独有,在少数散发性结直肠癌患者中也有发生。与遗传性结直肠癌相比,散发性结直肠癌缺乏相应的遗传学背景,目前涉及的发病机制主要包括染色体不稳定性（chromosomal instability,CIN）,CpG岛甲基化（CpG island methylator phenotype,CIMP）及微卫星不稳定（Microsatellite Instability,MSI）等[3]。微卫星（microsatellite,MS）又称短串联重复序列（short tandem repeats,STRs）,是指基因组中以少数几个核苷酸为单位串联重复的DNA序列,一般为1-6个核苷酸。由于DNA多聚酶的滑动,微卫星序列在复制过程中极易发生复制错误,导致一个或多个碱基的错配、插入、缺失,进而导致基因组的不稳定性,使得大量突变在细胞内累积,从而导致肿瘤的发生[9]。错配修复（mismatch repair,MMR）系统的主要作用是纠正上述错误,保证基因组的稳定性[9-13]。当错配修复系统发生功能异常时,微卫星的复制错误得不到纠正,导致微卫星序列长度或碱基组成发生改变的现象,称为微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）[9,14-17]。与MSI对应的状态是微卫星稳定（microsatellite stability,MSS）。错配修复基因产物主要包括四种错配修复蛋白（mismatch repair protein,MMRP）:MLH1、PMS2、MSH2、MSH6。错配修复基因突变可引起相应的错配修复蛋白表达缺失。目前MSI的检测方法主要有:聚合酶链反应法（polymerase chain reaction,PCR）、免疫组织化学染色方法（immunohistochemistry,IHC）及二代测序（next generation sequencing,NGS）[18]。临床上多采用免疫组织化学染色方法检测上述四种错配修复蛋白的表达,进而来判断微卫星状态[19]。四种错配修复蛋白均表达则判定为错配修复蛋白表达（proficient mismatch repair,pMMR）,即为MSS;四种错配修复蛋白中任意一种或几种不表达则判定为错配修复蛋白缺失（defective mismatchrepair,dMMR）,即为MSI。肿瘤的发生除了涉及肿瘤本身的遗传学改变外,免疫微环境发挥着重要作用。肿瘤免疫微环境主要由肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）及其相关的细胞因子、免疫检查点蛋白等组成[20]。程序性细胞死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）及程序性细胞死亡配体-1（programmed cell death ligand-1,PD-L1）通路是目前研究最多的免疫检查点蛋白通路[21-25]。近年来,阻断PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体在恶性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤的治疗中取得了显著疗效[26-29],但在结直肠癌中效果欠佳[30,31]。2010年Brahmer等[30]报道了 14例转移性结直肠癌患者接受PD-1抑制剂nivolumab治疗的I期临床试验,其中仅有1例患者达到了完全缓解。2012年在另外一项纳入207例转移性实体肿瘤患者接受PD-1抑制剂治疗的I期临床试验中,18例转移性结直肠癌患者均未达到客观缓解[31]。如何识别能从免疫治疗中获益的结直肠癌患者至关重要。2015年,Le等[32]在新英格兰医学杂志上报道了一项纳入了 41例晚期恶性肿瘤患者接受PD-1抑制剂pembrolizumab治疗的Ⅱ期临床试验,其中包括11例MSI的Ⅳ期结直肠癌,21例MSS的Ⅳ期结直肠癌及9例MSI的非结直肠癌患者,结果显示:MSI结直肠癌患者的免疫应答率和20周无进展生存率为40%和78%,在MSI非结直肠癌患者中分别为71%和67%,而在MSS结直肠癌患者中分别为0%和11%,研究表明PD-1抑制剂Pembrolizumab治疗MSI肿瘤的疗效明显优于MSS肿瘤。接下来进行的KEYNOTE-164研究进一步验证了 PD-1抑制剂pembrolizumab在MSI的转移性结直肠癌患者中的疗效[33]。另一项纳入了 74例MSI的复发性或转移性结直肠癌患者的CheckMate-142试验显示,PD-1抑制剂nivolumab对MSI转移性结直肠癌患者同样具有良好的疗效,客观缓解率（objective response rate,ORR）达 31.1%,中位无进展生存时间（progression-free survival,PFS）为 14.3 月[34]。上述研究提示相对于MSS的结直肠癌患者,MSI的结直肠癌患者更易在阻断PD-1/PD-L1通路的免疫治疗中获益。研究MSI与免疫微环境中免疫细胞及免疫检查点蛋白的关系,寻找免疫标记物,筛选可能从免疫治疗中获益的结直肠癌患者,具有重要的临床意义。肿瘤的发生除了涉及肿瘤本身的遗传学改变及免疫微环境外,还由复杂的系统性炎症反应所驱动。在炎症反应过程中,炎症细胞诱导肿瘤细胞发生氧化应激反应,导致DNA损伤,并抑制损伤后修复,导致肿瘤发生;同时炎症细胞和炎症因子会诱导多种细胞因子以及趋化因子的表达,促使细胞增殖及血管生成,促进肿瘤的发展及转移[35-38]。在临床上,系统性炎症反应通常经血液常规及血液生化等检测指标来判断,如白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、C反应蛋白（c-reactive protein,CRP）、白蛋白、中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio,NLR）、整合外周血淋巴细胞、中性粒细胞和血小板计数的系统性免疫炎症指数（systemic immune inflammation index,SII）、及 C 反应蛋白与白蛋白比值（c-reactive protein to albumin ratio,CAR）等。Park[39]等的研究提示MSI的结直肠癌患者伴有CRP、中性粒细胞升高。而在Pine[40]等的研究中并未发现MSI与系统性炎症反应的相关性。目前关于MSI与系统性炎症反应的研究较少,多为小样本量研究,研究结论不一。既往关于MSI的研究主要集中在Lynch综合征,关于MSI在散发性结直肠癌中的表达及其与免疫微环境、系统性炎症反应、预后的相关性研究较少,且结论存在争议。基于上述问题,本研究主要分三部分进行探讨:第一部分:研究MSI在散发性结直肠癌中的表达情况,分析MSI和散发性结直肠癌临床病理特征及预后的相关性,筛选影响散发性结直肠癌预后的独立因素。第二部分:研究散发性结直肠癌中肿瘤细胞PD-L1、TIL、免疫分型的表达,探讨MSI与免疫微环境的相关性。同时分析肿瘤细胞PD-L1、TIL与散发性结直肠癌临床病理特征及预后的关系,为筛选可能从免疫治疗中获益的结直肠癌患者提供依据。第三部分:研究散发性结直肠癌中白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、CRP、白蛋白、NLR、SII、CAR的表达,探讨MSI与系统性炎症反应的相关性。同时分析SII、CAR与散发性结直肠癌预后的关系。第一部分:微卫星不稳定在散发性结直肠癌中的表达及其与预后的相关性研究目的研究MSI在散发性结直肠癌中的表达情况,分析MSI和散发性结直肠癌临床病理特征及预后的相关性,筛选影响散发性结直肠癌预后的独立因素。方法研究纳入2015年10月至2016年12月于山东大学附属省立医院接受根治性结直肠癌手术的患者246例,通过免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织中错配修复蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的表达情况,根据错配修复蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）是否表达分为MSI及MSS,进而得出MSI的发生率。并选定9个临床病理特征（性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学分化程度、脉管侵犯、神经侵犯、TNM分期、CEA）,通过卡方检验、Kaplan-Meier生存分析、COX回归分析等分析MSI与上述9个临床病理特征及无病生存时间（disease-free survival,DFS）和总生存时间（overall survival,OS）的关系,筛选出影响散发性结直肠癌预后的独立因素。结果1.MSI的发生率:246例散发性结直肠癌患者中MSI的发生率为12.2%（30/246）,MSS的发生率为87.8%（216/246）,MLH1、PMS2、MSH2及MSH6表达缺失率分别为 6.9%（17/246）、8.5%（21/246）、2.4%（6/246）、3.3%（8/246）。其中 PMS2单独表达缺失率为1.6%（4/246）,MSH2单独表达缺失率为0.4%（1/246）,MSH6单独表达缺失率为1.2%（3/246）,MLH1/PMS2共同表达缺失率为6.9%（17/246）,MSH2/MSH6共同表达缺失率为2.0%（5/246）。MLH1与PMS2表达、MSH2与MSH6 表达呈正相关（rs=0.892,P＜0.001;rs=0.714,P＜0.001）。2.MSI与临床病理特征的关系:MSI与肿瘤部位（P＜0.001）、肿瘤大小（P=0.002）、TNM分期（P=0.004）有关,即MSI在右半结肠、肿瘤最大直径>4cm、TNM分期II期时多见。MSI与性别、年龄、组织学分化程度、脉管侵犯、神经侵犯、CEA无关（P＞0.05）。3.MSI组的中位DFS为42.5月,中位OS为43.5月;MSS组的中位DFS为37.0月,中位 OS 为 37.0 月,MSI 组的 DFS 和 OS 均优于 MSS 组（P=0.006,P=0.007）。4.采用COX比例风险回归模型分析,MSI、组织学分化程度及TNM分期是影响DFS及OS的独立因素（P＜0.05）。结论1.MSI不仅仅发生在Lynch综合征,在散发性结直肠癌中也有一定的发生率（12.2%）。2.MSI的散发性结直肠癌具有独特的临床病理特征:与肿瘤部位、肿瘤大小、TNM分期密切相关（右半结肠、肿瘤最大直径>4cm、TNM分期Ⅱ期）。3.在散发性结直肠癌群体中,MSI患者的预后优于MSS患者。4.MSI、组织学分化程度及TNM分期是影响散发性结直肠癌预后的独立因素。第二部分:微卫星不稳定与散发性结直肠癌免疫微环境的相关性研究目的研究散发性结直肠癌中肿瘤细胞PD-L1、TIL、免疫分型的表达,探讨MSI与免疫微环境的相关性。同时分析肿瘤细胞PD-L1、TIL与散发性结直肠癌临床病理特征及预后的关系。方法研究纳入2015年10月至2016年12月于山东大学附属省立医院接受根治性结直肠癌手术的MSI的散发性结直肠癌患者30例,以1:2进行匹配,匹配出MSS的散发性结直肠癌患者60例;对该90例患者,通过免疫组织化学染色方法检测肿瘤细胞PD-L1的表达,并判断TIL的水平,对其进行免疫分型:I型PD-L1+/高TIL;Ⅱ 型 PD-L1-/低 TIL;III 型 PD-L1+/低 TIL;Ⅳ 型 PD-L1-/高 TIL。通过卡方检验、Kaplan-Meier生存分析等分析MSI与肿瘤细胞PD-L1、TIL及免疫分型的相关性;肿瘤细胞PD-L1、TIL与临床病理特征及DFS和OS的关系。结果1.90例散发性结直肠癌患者中肿瘤细胞PD-L1+为23.3%（21/90）。其中MSI组肿瘤细胞 PD-L1+为 36.7%（11/30）,MSS 组肿瘤细胞 PD-L1+为 16.7%（10/60）。MSI组肿瘤细胞PD-L1表达阳性率高于MSS组（P=0.034）。2.90例散发性结直肠癌患者中高TIL为58.9%（53/90）,其中MSI组高TIL为73.3%（22/30）,MSS 组高 TIL 为 51.7%（31/60）,MSI 组 TIL 水平高于 MSS 组（P=0.049）。3.90例散发性结直肠癌患者中免疫分型I型为17.8%（16/90）,Ⅱ型为35.6%（32/90）,Ⅲ 型为 5.6%（5/90）,Ⅳ 型为 41.1%（37/90）,其中 MSI 组 Ⅰ 型为 26.7%（8/30）,Ⅲ 型为 16.7%（5/30）,Ⅲ 型为 10.0%（3/30）,Ⅳ 型为 46.7%（14/30）,MSS 组Ⅰ 型为 13.3%（8/60）,Ⅱ 型为 45.0%（27/60）,Ⅲ 型为 3.3%（2/60）,Ⅳ 型为 38.3%（23/60）,MSI组和MSS组的免疫分型存在差异（P=0.026）。4.肿瘤细胞PD-L1的表达与肿瘤部位（P=0.001）、组织学分化程度（P=3.001）有关,即右半结肠肿瘤、组织学低分化时,肿瘤细胞PD-L1表达上调。肿瘤细胞PD-L1的表达与性别、年龄、肿瘤大小、T分期、淋巴结转移、TNM分期、CEA无关（P＞0.05）。5.TIL水平与肿瘤部位（P=0.007）有关,即右半结肠肿瘤,TIL水平升高。TIL水平与性别、年龄、肿瘤大小、组织学分化程度、T分期、淋巴结转移、TNM分期、CEA 无关（P>0.05）。6.肿瘤细胞PD-L1+组的中位DFS为42.0月,中位OS为42.0月,肿瘤细胞PD-L1-组的中位DFS为39.0月,中位OS为40.0月,两组之间的DFS及OS无统计学差异（P＞0.05）。7.高TIL组的中位DFS为41.0月,中位OS为41.0月,低TIL组的中位DFS为37.0月,中位OS为37.0月,高TIL组DFS及OS均优于低TIL组（P=0.023,P=0.047）。结论1.在散发性结直肠癌患者中,MSI影响肿瘤细胞PD-L1、TIL及免疫分型的表达,MSI散发性结直肠癌患者为免疫治疗的潜在受益人群。2.右半结肠肿瘤,组织学低分化时,肿瘤细胞PD-L1表达上调。3.右半结肠肿瘤,TIL水平升高。4.TIL影响散发性结直肠癌的预后,肿瘤细胞PD-L1与散发性结直肠癌的预后无关。第三部分:微卫星不稳定与散发性结直肠癌系统性炎症反应的相关性研究目的研究散发性结直肠癌中白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、CRP、白蛋白、NLR、SII、CAR的表达,探讨MSI与系统性炎症反应的相关性。同时分析SII、CAR与散发性结直肠癌预后的关系。方法研究纳入2015年10月至2016年12月于山东大学附属省立医院接受根治性结直肠癌手术的患者,术前1周内进行了血液常规及血液生化的检测,术后检测了错配修复蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的表达,根据纳入及排除标准,有效入组241例,根据患者术前血液学参数计算系统性炎症反应相关指标:NLR、SII、CAR,采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）计算上述指标的临界值,通过t检验,卡方检验分析MSI与系统性炎症反应指标的相关性,通过Kaplan-Meier生存分析等分析SII、CAR与DFS和OS的关系。结果1.MSI的散发性结直肠癌患者的血小板（P<0.001）及SII升高（P=0.007）。MSI和MSS的散发性结直肠癌患者的白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、白蛋白、CRP、NLR、CAR不具有统计学差异（P＞0.05）。2.SII＜557组的中位DFS为40.0月,中位OS为41.0月,SII≥557组的中位DFS为37.0月,中位OS为37.0月,SII＜557组的DFS优于SII≥557组（P=0.012）,两组之间的OS无统计学差异（P＞0.05）。3.CAR<0.04组的中位DFS为40.0月,中位OS为41.0月,CAR≥0.04组的中位DFS为37.0月,中位OS为38.0月,CAR<0.04组的OS优于CAR≥0.04组（P=0.049）,两组之间的DFS无统计学差异（P＞0.05）。4.在MSI患者中,SII＜557组的中位DFS为40.0月,中位OS为40.0月,SII≥557组的中位DFS为44.0月,中位OS为44.0月,两组之间的DFS和OS无统计学差异（P＞0.05）。5.在MSS患者中,SII<557组的中位DFS为40.0月,中位OS为41.0月,SII≥557组的中位DFS为36.0月,中位OS为36.0月,SII＜557组的DFS和OS均优于SII≥557组（P=0.003,P=0.015）。6.在MSI患者中,CAR<0.04组的中位DFS为38.5月,中位OS为42.5月,CAR≥0.04组的中位DFS为43.5月,中位OS为43.5月,两组之间的DFS和OS无统计学差异（P＞0.05）。7.在MSS患者中,CAR<0.04组的中位DFS为40.0月,中位OS为41.0月,CAR≥0.04组的中位DFS为37.0月,中位OS为37.0月,CAR<0.04组的DFS和OS均优于CAR≥0.04组（P=0.038,P=0.028）。结论1.在散发性结直肠癌中,MSI影响血小板和SII的表达。2.SII与散发性结直肠癌的DFS相关,CAR与散发性结直肠癌的OS相关,SII和CAR在MSS散发性结直肠癌患者中预后价值更高。