铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginoisa,PA）是一种条件致病的革兰阴性杆菌,其广泛存在于自然界及人的皮肤、呼吸道及肠道中,主要引起通风性呼吸道感染、烧伤性继发性感染和囊性纤维化病人的继发性肺炎及全身系统的感染,是临床常见的耐药菌之一。目前多重耐药和泛耐药铜绿假单胞菌分离率较高,再加上铜绿假单胞菌引起的感染症状较严重,进而给临床抗感染治疗带来巨大困难。铜绿假单胞菌导致的多种急性和慢性感染与其活性的毒力因子密切相关,毒力因子活性越强,引起的感染症状越严重,治疗难度越大。PA的毒力因子受四个群体感应（Quorum Sensing,QS）系统,即以高丝氨酸内酯为信号分子的las系统,rhl系统,以喹诺酮类为信号分子的pqs系统及iqs系统的调控,四个系统对毒力因子的调控机制相互影响,交叉复杂,子系统间存在级联调节机制。喹诺酮信号分子（Pseudomonas quinolone signal,PQS）是pqs系统中多功能且至关重要的信号分子,它参与各种毒力因子的调控、细菌的菌群密度、营养物质的运输如Fe³⁺、抗生素敏感性、膜囊泡的形成,以及对宿主免疫系统的抑制等。本课题探究了在外源性PQS不同诱导方案下铜绿假单胞菌对临床常用抗生素敏感性变化,以及不同诱导方案对毒力因子和QS相关基因表达的影响。1.外源性PQS不同诱导方案下铜绿假单胞菌对临床常用药物敏感性的影响目的:探究铜绿假单胞菌经外源性PQS不同诱导方案处理后对临床常用药物敏感性的影响方法:（1）菌株的选取及处理:收集临床血培养及胸水腹水等无菌体液中分离的对环丙沙星、哌拉西林、头孢他啶、阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦、头孢吡肟和美罗培南敏感的铜绿假单胞菌,经VITEK-2重新鉴定,与PAO1（质控菌株）一起作为原始菌株,在分别含不同浓度（10,40,80μM）PQS的培养基中培养5天,每完成一天的培养需更换相同浓度的新培养基,将恒温培养24h（1天）的菌株定义为诱导第一天的菌株,以此类推,保存诱导后第一天,第三天和第五天的菌株,与原始菌株一起作为实验菌株。（2）敏感性的测定:采用琼脂倍比稀释法测定铜绿假单胞菌对环丙沙星的最低抑菌浓度（MIC）,采用纸片扩散法测定铜绿假单胞菌对哌拉西林、头孢他啶、阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦、头孢吡肟和美罗培南的抑菌圈直径,根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2017年公布的标准对实验结果进行判定。（3）统计分析:用SPSS 20.0软件进行统计分析。外源性PQS不同诱导方案下铜绿假单胞菌对环丙沙星的MIC值采用重复测量方差分析方法进行统计分析,P<0.05认为有统计学差异。结果:（1）实验菌株:收集来自血培养和无菌体液的敏感菌株共11株,与PAO1一起作为原始菌株,经PQS3个浓度体外诱导5天之后保存第一天,第三天以及第五天的菌株,构成12个菌株系列,共保存120株实验菌。（2）实验菌株对环丙沙星的MIC值:外源性PQS不同诱导方案下实验菌株对环丙沙星的MIC值结果显示PQS的诱导浓度与诱导时间之间有交互作用（P<0.05）,即不同PQS诱导浓度下对环丙沙星的MIC值随诱导时间的延长变化的趋势不同;不考虑诱导浓度的影响,各诱导时间下MIC值的变化趋势不同（P<0.001）。（3）实验菌株对其他抗生素的抑菌圈直径:外源性PQS不同诱导方案处理前后实验菌株对其他抗生素的抑菌圈直径变化不明显。（4）敏感性结果:外源性PQS不同诱导方案处理前后实验菌株对环丙沙星、哌拉西林、头孢他啶、阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦、头孢吡肟和美罗培南药物的敏感率均为100%。2.外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌毒力表型的影响目的:探讨外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌泳动能力、绿脓菌素活性弹性蛋白酶活性及生物膜形成能力等毒力表型的影响。方法:（1）毒力因子的测定:泳动能力通过浑浊圈的大小来测定,采用氯仿盐酸双相萃取法测定绿脓菌素活性,采用酶解染色法测定弹性蛋白酶活性,采用结晶紫染色法测定生物膜的形成能力,所有实验需独立重复三次。（2）统计分析:外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌泳动能力、绿脓菌素活性、弹性蛋白酶活性及生物膜形成能力等毒力表型的影响采用重复测量方差分析进行统计分析,P<0.05认为有统计学差异。结果:（1）对泳动能力的影响:整体上看,外源性PQS不同诱导方案与诱导前比较对铜绿假单胞菌的泳动能力除80μM诱导第五天对泳动能力呈抑制作用外均呈促进作用。具体地,浓度为10μM时铜绿假单胞菌的泳动能力随诱导时间的延长呈持续促进趋势,浓度为40μM和80μM时随诱导时间的延长呈先促进后抑制的趋势。经重复测量方差分析,PQS的诱导浓度与诱导时间之间有交互作用（P=0.048）,即不同PQS诱导浓度下,铜绿假单胞菌的泳动能力随诱导时间的延长变化趋势不同。主效应分析结果不具有统计学意义。进一步单独效应分析:诱导浓度为40μM时,各诱导时间对泳动能力的影响具有统计学差异（P=0.006）,随诱导时间的延长呈先促进后抑制的趋势,诱导第三天对泳动能力的促进作用最强。诱导3天时,各诱导浓度对泳动能力的影响具有统计学差异（P=0.0011）,在40μM对泳动能力的促进作用最强。（2）对绿脓菌素活性的影响:整体上看,与诱导前相比外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌绿脓菌素活性呈促进作用,具体地,浓度为10μM时铜绿假单胞菌的绿脓菌素活性随诱导时间的延长逐渐增强,浓度为40μM和80μM时绿脓菌素活性随诱导时间的延长呈先增强后减弱的趋势,均在诱导第三天时绿脓菌素活性达到最大。经重复测量方差分析PQS的诱导浓度与诱导时间之间无交互作用（P=0.574）,即不同PQS诱导浓度下,铜绿假单胞菌绿脓菌素活性随诱导时间的延长变化的趋势相同。不考虑诱导浓度间的差异,不同诱导时间对绿脓菌素活性的影响具有统计学差异（P=0.001）,随诱导时间的延长绿脓菌素活性呈先增强后减弱趋势;不考虑诱导时间之间的差异,不同诱导浓度对绿脓菌素活性的影响具有统计学差异（P=0.028）,随诱导浓度的增大绿脓菌素活性逐渐增强。进一步单独效应分析:从诱导浓度看,诱导浓度为80μM时,不同诱导时间对绿脓菌素活性的影响具有统计学差异,随诱导时间的延长绿脓菌素活性呈先增强后减弱的趋势,诱导第三天时绿脓菌素活性最强。从诱导时间来看,诱导3天时,不同诱导浓度对绿脓菌素活性的影响具有统计学差异（P=0.018）,随诱导浓度的增大绿脓菌素活性逐渐增强,浓度为80μM时绿脓菌素活性最强。（3）对弹性蛋白酶活性的影响:整体上看,与诱导前相比外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶活性均增强,并随诱导时间的延长呈先增强后减弱的趋势。具体地,浓度为10μM时铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶活性随诱导时间的延长逐渐增强,浓度为40μM时在诱导第一天绿脓菌素活性最强,浓度为80μM时绿脓菌素活性随诱导时间的延长呈先增强后减弱的趋势。经重复测量方差分析,PQS的诱导浓度与诱导时间之间无交互作用（P=0.460）,即不同PQS诱导浓度下,铜绿假单胞菌弹性蛋白酶活性随诱导时间的延长变化的趋势相同。不考虑诱导浓度之间的差异,不同诱导时间对弹性蛋白酶的形成的影响具有统计学差异（P=0.001）,随诱导时间的延长弹性蛋白酶活性呈先增强后抑制趋势。进一步单独效应分析:诱导浓度为10μM时,不同诱导时间对弹性蛋白酶活性的影响具有统计学差异,随诱导时间的延长铜绿假单胞菌弹性蛋白酶活性逐渐增强;诱导浓度为80μM时,不同诱导时间对弹性蛋白酶活性的影响具有统计学差异,随诱导时间的延长呈先促进后抑制趋势。（4）对生物膜形成能力的影响:从整体上看,与诱导前相比外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌生物膜形成呈弱抑制的趋势。经重复测量方差分析,PQS的诱导浓度与诱导时间之间无交互作用（P=0.864）,即不同PQS诱导浓度下,铜绿假单胞菌生物膜形成能力随诱导时间的延长变化的趋势相同。主效应分析和单独效应分析结果均不具有统计学意义。3.外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌QS基因表达的影响目的:探究外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌QS基因表达的影响,并进一步探讨QS相关基因与毒力因子表型的关系。方法:（1）菌株选取:在1-11号菌株系列采用抽签法随机选取3个菌株系列,与PAO1系列（0号菌株系列）一起构成48株实验菌进行实验（2）QS基因表达的测定:设计lasI,lasR,rhlI,rhlR和pqsR的引物,提取菌株的总RNA,逆转录合成cDNA,以GAPDH为内参基因,通过实时荧光定量PCR进行扩增,采用相对定量2^-△△CT法对RT-PCR数据进行整理分析。（3）统计分析:外源性PQS不同诱导方案对铜绿假单胞菌QS基因表达的影响采用重复测量方差分析方法进行统计分析,QS基因表达与毒力表型间的相关性采用Pearson积差相关进行统计分析,P<0.05认为有统计学差异。结果:（1）菌株的选择:最终选择0,1,5,10号四个菌株系列共48株菌进行QS基因扩增实验（2）QS基因表达:从整体上看与诱导前比,PQS上调了lasI,rhlI和pqsR基因的表达,对lasR和rhlR的表达呈小幅下调趋势。经重复测量方差分析,对于lasI,rhlI rhlR以及pqsR诱导时间和浓度之间有交互作用（P均<0.05）。即随诱导时间的延长,各浓度基因表达量的变化趋势不同。对于lasR,诱导时间和浓度之间无交互作用,即随诱导时间的延长,各浓度下基因相对表达量的变化趋势相同。不考虑诱导时间,各诱导浓度对pqsR的相对表达量的影响具有统计学差异（P<0.05）,随诱导浓度的增大上调作用增强。不考虑诱导浓度,不同诱导时间对lasI,rhlI和pqsR相对表达量的影响均具有统计学差异（P均<0.05）。PQS不同时间的诱导使得lasI呈上调趋势,上调作用先增强后减弱;对rhlI先上调后下调,上调作用减弱而后下调作用逐渐增强;对pqsR先上调后呈微弱下调趋势,上调作用先增强后逐渐减弱。（3）QS基因表达与毒力因子活性的相关性:rhlR基因与不同浓度PQS不同时间诱导引起泳动能力的先促进后抑制作用高度负相关（P<0.001 r=-0.921）,lasI基因则与泳动表型低度相关（P=0.011,r=0.449）,表明PQS可能通过下调rhlR基因和上调lasI的表达增强铜绿假单胞菌的泳动能力。pqsR基因与绿脓菌素表型低度正相关（P=0.405,r=0.318）,PQS可能通过上调pqsR基因的表达增强绿脓菌素的活性。pqsR基因与不同浓度PQS不同时间诱导引起弹性蛋白酶先促进后抑制作用呈中度正相关（P<0.05,r=0.652）,lasI和rhlR基因则与弹性蛋白酶表型低度相关（r=0.328,P=0.389;r=-0.444,P=0.231）,PQS可能通过上调pqsR和lasI下调rhlR的表达增强弹性蛋白酶的活性。rhlR基因与不同浓度PQS不同时间诱导引起生物膜的抑制作用呈中度正相关（P均<0.05,r=0.576）,lasR与生物膜表型低度正相关（P=0.221,r=0.453）,可能PQS通过下调lasR和rhlR基因的表达进而对生物膜的形成呈弱抑制作用。结论:1.外源性喹诺酮信号分子不同诱导方案并未引起铜绿假单胞菌对常见抗生素敏感性的变化。2.较低浓度（10μM）的外源性PQS对毒力表型呈单一的影响,而较高浓度（40μM,80μM）的PQS对毒力表型具有双向调控作用。3.PQS可能通过下调rhlR基因和上调lasI的表达增强铜绿假单胞菌的泳动能力,上调pqsR基因的表达增强绿脓菌素的活性,上调pqsR和lasI下调rhlR的表达增强弹性蛋白酶的活性,下调lasR和rhlR基因的表达进而对生物膜的形成呈弱抑制作用。