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几丁质是自然界中第二大可再生的天然高分子化合物,其降解产物N-乙酰-D-氨基葡萄糖在食品、化妆品、医药、农业、生物燃料等领域有着广泛的应用价值。目前几丁质主要采用化学法降解,生产效率低,污染严重。酶法降解几丁质对环境友好,产品纯度高,是产业发展的方向。本实验室在苜蓿链霉菌Streptomyces alfalfae ACCC40021全基因组测序和CAZy分析的基础之上,发现一个属于GH18家族的几丁质酶基因Sachi18e。本课题研究了该几丁质酶的酶学性质;通过蛋白质工程技术改造,使其水解胶体几丁质产生N-乙酰-D-氨基葡萄糖。1、本研究克隆并在大肠杆菌中可溶性表达了几丁质酶SaChi18E。通过镍柱亲和层析纯化了重组酶,并研究了其酶学性质。以胶体几丁质为底物,该酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0,在4℃以下具有很好的热稳定性,在pH为5.0-11.0范围内具有良好的pH稳定性。薄层色谱分析SaChi18E作用方式为内切。以胶体几丁质为底物几丁质酶的 Km为 0.41 mg/mL,Vmax为 25.06 U/mg,Kcat为 34.09 s-1,Kcat/Km为82.95 mL/(mg·s)。2、为了提高水解几丁质,一步转化几丁质为GlcNAc的效率,我们在SaChi18E的C端融合了属于GH20家族的N-乙酰氨基己糖苷酶SaHEX,构建了融合几丁质酶SaChi 18E-HEX,并在大肠杆菌中实现了可溶性表达。SaChi18E-HEX的最适pH为5.0,最适温度为40℃,在pH为4.0-9.0范围内具有良好的稳定性。薄层色谱分析表明融合几丁质酶作用方式为内切与外切协同作用。融合几丁质酶水解胶体几丁质产生GlcNAc的效率是已报道的转化率最高的几丁质酶CmChi1的5.9倍。HPLC结果显示SaChi18E-HEX转化1%胶体几丁质4 h达到最大转化率98.5%,GlcNAc为唯一产物(纯度>98.5%)。MALDI-TOF质谱分析进一步确定Sachi18E-HEX水解胶体几丁质的终产物为GlcNAc。本研究结果表明:新型融合几丁质酶具有工业化酶法分解几丁质制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖的潜力。