论文部分内容阅读
氨肽酶是一类外切蛋白酶,作用位点与内切蛋白酶相互补充,在蛋白质酶解过程中与内切蛋白酶协同作用可有效提高酶解产物的水解度和游离氨基酸的含量、改善酶解产物的风味。但由于可选择的产品种类较少,氨肽酶的广泛应用暂未实现。本论文筛选到了1株高产氨肽酶的菌株,研究了该菌株以大豆粕为底物发酵产氨肽酶及放大发酵的工艺,对所产氨肽酶进行了分离纯化并研究了其酶学性质,采用多种不同的复杂底物研究了氨肽酶的酶解特异性,结合氨肽酶的底物特异性探索了其在酶解花生分离蛋白与玉米醇溶蛋白中的特性及对酶解产物抗氧化活性和ACE抑制活性的影响。论文主要研究内容和结果如下:(1)从海洋沉积物中筛选到氨肽酶生产菌种Bacillus licheniformis SWJS33,其摇瓶发酵产氨肽酶的培养基及培养条件如下:葡萄糖5 g,酵母粉10 g,KH2PO4 0.5 g,CaCl2·2H2O 1 g,(NH4)2SO4 1 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,NaCl 20 g,蒸馏水1 L,pH 7.2;装液量为10%,发酵温度37°C,摇床转速180 rpm,发酵时间40 h。优化条件下氨肽酶活力为1.90 LAP/mL,遗传性质稳定。(2)大豆粕可直接作为菌株SWJS33发酵产氨肽酶的底物,同时提供碳源、氮源,在发酵初期补充3 g/L葡萄糖或15 g/L酵母提取粉能分别将氨肽酶产量提高73.7%和53.7%。补充酵母提取粉能有效地缩短菌种的迟缓期,提高菌体的比生长速率和产物比合成速率,并缩短二者达到最大值的时间。经过优化,SWJS33在2.5L发酵罐中氨肽酶活力达4.95 LAP/mL,与摇瓶发酵相比提高了1.6倍。实现了在20L发酵罐中初步扩大生产,发酵液氨肽酶活力为4.35 LAP/mL。(3)通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶柱层析等步骤将Bacillus licheniformis SWJS33所产的氨肽酶(aminopeptidase from Bacillus licheniformis SWJS3,BLAP)纯化到了电泳纯,分子量为100 kDa。电泳纯的BLAP经串联质谱鉴定,与来源于Bacillus licheniformis ATCC14580(gi|52079505)的氨肽酶的匹配度最高。纯化后的BLAP最适反应温度为60℃,温度低于70℃时有较好的稳定性。最适pH为pH 8.0–8.5,在pH6.0–10.0的范围内有较好的稳定性。10–15%的NaCl能将BLAP的活力提高50%。1 mM的Co2+和Ag+能提高氨肽酶的活性,EDTA与bestatin则对酶活力有抑制作用,表明BLAP属于金属氨肽酶。BLAP对底物Leu-pNA的特异性最高,以Leu-pNA为底物时Km与Vmax分别为1.85 mmol L-1和1.69 mmol(L·min)-1。(4)采用系列合成肽、合成肽混合物及蛋白酶解物等多种底物全面研究了BLAP的酶解特异性,BLAP在复杂底物中表现出的特异性与以AA-pNA为底物时的特异性并不完全一致,N端第二位、第三位氨基酸残基都会影响BLAP的酶解效率。以混合二肽为底物时,BLAP对N端为Leu、Val、Ala与Gly的二肽有较高的选择性;以A-SPHs为底物时,游离氨基酸分析结果显示,BLAP优先水解N端为Leu、Glu、Gly与Ala的肽,肽序列鉴定结果显示BLAP优先水解N端为Leu、Ala、Ser、Glu、Asn与Val的肽。综合以上结果,N端为Leu的肽键是BLAP优先酶切位点,其次是N端为Gly、Ala、Glu与Val的肽键。(5)BLAP的应用对花生分离蛋白(peanut protein isolate,PPI)与玉米醇溶蛋白(zein)酶解产物的水解度都有提高,但对提高zein水解度的作用更加显著。BLAP的底物特异性对酶解产物中游离氨基酸的组成和释放规律有较大的影响,对Leu含量差异较大的PPI和zein都能显著提高Leu在游离氨基酸中所占的比例和释放比例。BLAP的应用能显著提高PPI与zein酶解产物的抗氧化活性,对zein酶解产物的ACE抑制活性也有一定的提升,将IC50值为从0.114 mg/mL降低到0.099mg/mL。与原料蛋白的氨基酸组成相比,BLAP的应用能提高PPI酶解物活性组分(超滤后分子量小于3 kDa的组分)中Glu、Val与Leu的所占比例,提高zein酶解物活性组成中Glu、Ala与Leu的比例。BLAP对酶解产物中多肽组成的影响受与其复配的内切蛋白酶特异性的影响,与内切蛋白酶单独作用的酶解产物相比,肽序列有差异性,但主要酶解的蛋白亚基基本一致。