论文部分内容阅读
小球藻是常见的单细胞经济绿藻,光合效率高,是研究光合作用、叶绿体发生等的良好材料。RbcS是卡尔文循环关键酶Rubisco的小亚基,具有调节Rubisco酶活性的作用。本研究以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)820为试验材料,克隆并分析了其rbcS基因的cDNA和DNA序列,并通过绿色荧光蛋白(GFP)报告基因研究了rbcS启动子在盐生杜氏藻(Dunaliella salina)中的启动子活性。具体结果如下:1、首先根据数据库中其它绿藻的rbcS核苷酸和氨基酸的保守序列设计了一对简并引物(RF/RR),从蛋白核小球藻820中扩增得到一条长245 bp的cDNA片段。以该部分cDNA序列为基础,设计上、下游特异性引物,利用RACE技术克隆其两侧未知序列,拼接后得到长为907 bp的rbcS基因cDNA的全序列(GenBank号GQ355312)。序列分析表明蛋白核小球藻820该rbcS cDNA编码184个氨基酸,其中转运肽和成熟肽分别由44和140个氨基酸组成。编码区具有与高等植物rbcS 16个氨基酸的保守序列相类似的结构—YQDNRYWTMWKLPMFG,起始密码子附近有Kozak保守序列(A/GXXATGG),3’非翻译区有加尾信号TGTAA。2、以基因组DNA为模板,利用简并引物(RF/RR)扩增得到3条rbcS DNA序列。利用基因组步移技术,克隆得到其中两条rbcS基因的DNA全序列—rbcS1和rbcS2。对该两条序列进行分析发现rbcS2与获得的rbcS cDNA序列一致,该基因有5个外显子和4个内含子,外显子与内含子的剪切符合“GT/AG”规则。并从rbcS2序列的5’上游序列找到了推测的-35元件、TATA box、CAAT box等启动子作用元件,而rbcS1中则没有找到。3、分别将rbcS2 5’上游4条推测的启动子片段(长度依次为361 bp、528 bp、907 bp和1302 bp)与绿色荧光蛋白报告基因(pAcGFP1-1质粒)构建成重组质粒,利用电激转化的方法在盐生杜氏藻中进行启动子活性检测。荧光显微镜观察发现转化3天后开始出现转化的黄色藻,至第6天达到转化的高峰。结果显示4条不同长度的启动子片段都可以启动GFP在盐生杜氏藻中的表达,并且其表达量没有显著差异。说明蛋白核小球藻820的rbcS2具有启动子活性。