鸭源鸡杆菌(Galllibacterium anatis,G.anatis)属于革兰氏阴性菌鸡杆菌属代表种,常定居于家禽的呼吸道和生殖道。它是卵巢炎、输卵管炎和腹膜炎以及母鸡的产蛋量下降、死亡的重要原因,由于多重耐药性的普遍存在且本身抗原多样性的存在,使得传统的抗菌治疗及疫苗防预效果不理想,严重影响了世界家禽产业的动物福利和总体生产力,对养禽业造成很大的经济损失。目前,对鸭源鸡杆菌的毒力因子及其致病机理的研究已成国内外研究的热点。TolC蛋白是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的外膜通道蛋白,已在多种病原菌中被鉴定为重要的毒力因子,解析鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白在该菌中的生物学功能对其致病机制研究具有重要意义。本研究首先分析了tolC基因在鸭源鸡杆菌各分离菌株中分布情况,然后以临床分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG(RZ)为研究材料,预测分析TolC同源蛋白在鸭源鸡杆菌的定位、各级结构及线性B细胞抗原表位,并分析其免疫原性;最后构建鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株(RZΔtolC),并探究其生物学特性。具体工作如下:1.鸭源鸡杆菌tolC基因扩增及生物信息学分析参考GenBank中鸭源鸡杆菌UMN179基因组信息,查找tolC基因及其上下游序列,设计特异性通用扩增引物,PCR扩增28株鸭源鸡杆菌tolC基因并测序,对其存在状态分析。并以临床分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG为研究对象,对鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白进行氨基酸序列、理化性质、信号肽及结构域分析以及线性B细胞抗原表位的预测。结果表明,tolC基因在各鸭源鸡杆菌中普遍存在,且具有较高的保守性;鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白在N端1～21aa处存在一个α螺旋结构的信号肽序列,定位于细胞膜;TolC同源蛋白为三个单体形成的长桶状结构,其氨基酸序列只存在个别氨基酸突变;各分离株具有相同的B细胞抗原表位,它们可能具有交叉免疫原性:该研究为鸭源鸡杆菌检测方法建立、新型疫苗研制及TolC同源蛋白生物学功能的研究奠定基础。2.鸭源鸡杆菌tolC基因原核表达及抗原性鉴定应用PCR技术扩增tolC基因片段(无信号肽),连入原核表达质粒pET-28a构建原核表达载体,转化BL21后,使用IPTG成功诱导得到高效表达的TolC同源蛋白包涵体,经纯化后免疫家兔获得抗TolC同源蛋白的多克隆抗血清,并通过Western blotting对其免疫原性进行初步鉴定。结果显示,重组TolC同源蛋白具有良好的免疫原性,且获得的抗TolC同源蛋白多抗能够与不同分离株发生免疫反应,说明鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白具有交叉保护能力的潜能,有利于鸭源鸡杆菌血清学检测方法的建立,也为后续鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的验证提供支持。3.鸭源鸡杆菌tolC基因敲除株的构建及生物学特性分析参考GenBank中鸭源鸡杆菌UMN179(NC015460.1)基因组信息,扩增RZ株tolC及其上下基因并进行测序,根据测序结果设计上、下游同源臂引物。将上、下游同源臂与卡那霉素抗性盒子分别连入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD1 8-S-K-X,并设计特异性引物扩增S-K-X DNA片段。将S-K-X DNA片段通过自然转化法成功转入制备的鸭源鸡杆菌感受态,卡那抗性筛选获得tolC基因缺失株RZΔtolC,并对RZ、RZΔtolC生长特性、生物被膜形成能力、MIC及鸡输卵管原代细胞黏附能力进行测定。结果显示,RZΔtolC对数生长期延迟,且整体生长速度较RZ株慢;RZΔtolC株生物被膜形成能力较RZ株弱,且差异显著;RZΔtolC株对磷霉素的MIC值下降32倍,卡那霉素上升16倍,新霉素上升2倍,多西环素下降4倍。鸭源鸡杆菌RZΔtolC株的构建及其生物学特性分析为探索鸭源鸡杆菌TolC功能及鸭源鸡杆菌致病机理和耐药相关机制的阐明奠定了基础。