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本实验利用基因工程技术保留白喉毒素N端389个氨基酸的基因序列,即白喉毒素的毒性区和跨膜区,而用人18KDbFGF基因序列替代白喉毒素的细胞结合区序列构建成pGEX-DT389-hbFGF嵌合毒素质粒并原核表达、纯化;10%SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色及Westernblot鉴定表达蛋白并通过Brandford染色法测定融合蛋白的浓度;MTT比色法测定免疫毒素不同剂量、不同作用时间对体外培养的人晶状体上皮细胞(HLECs)成活率的影响及DT多抗对免疫毒素毒性作用的抑制;流氏细胞术检测不同剂量免疫毒素所致细胞死亡方式。结果如下:
1.克隆获得序列正确、包含DT毒性区及跨膜区基因序列的pGEM-DT389质粒。
2.以孕12周人胎脑皮质为材料,较容易地获得序列正确的18KDbFGF基因序列,为bFGF基因序列的获得提供了一条便利途径。
3.克隆获得序列正确的pGEX-DT389-hbFGF重组表达质粒,其中包含DT毒性区、跨膜区、18KDbFGF三段基因序列。
4.通过控制诱导表达条件,使表达产物主要存在于上清中。纯化后表达蛋白浓度约为0.47mg/ml。
5.成功培养人晶状体上皮细胞并传代用于细胞毒性实验。
6.MTT实验显示重组免疫毒素DT389-hbFGF对体外培养HLECs有明显毒性作用,且在一定范围内存在剂量、时间依赖性,半数致死量约3.8×10-11mol/L,DT多抗可明显抑制免疫毒素的毒性作用。
7.流氏细胞术证明不同剂量免疫毒素所致体外培养HLECs死亡方式主要以凋亡为主。
本研究旨在尝试利用hbFGF与HLECs表面FGF受体特异性结合,引发白喉外毒素对HLECs的杀伤作用,从而清除HLECs,使PCO丧失形成的物质基础,阻止PCO的发生,进一步完善白内障治疗。