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目的:肺泡Ⅱ型（AT2）细胞是维持肺泡区内环境稳定的组织干细胞,其功能之一为分泌肺表面活性物质,防止肺泡塌陷,参与肺泡免疫调控。肺表面活性物质是由AT2细胞合成的一种复杂的脂质和相关蛋白的混合物。板层小体（Lbs）是成熟AT2细胞特有的溶酶体相关细胞器,是一种肺表面活性物质储存和分泌的形式。板层小体的形成不仅需要多泡体,而且还需要多泡体囊泡中的糖原颗粒和核糖体。肺表面活性物质由磷脂(其中很大一部分是二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、胆固醇和表面活性剂相关蛋白组成。它们分别占80%、10%和10%,作为一个完整的功能系统三样组分都很重要,肺表面活性物质的分子结构与胆固醇浓度密切相关,肺表面活性物质准确的相行为强烈地取决于肺表面活性物质的脂质-蛋白质混合物的确切组成、水含量、溶液条件以及温度和压力等外部条件。这些参数中任何一个参数的微小变化都可能导致相界位置的移动。转运必需的内体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）是一个广泛存在于酵母与真核动植物细胞中的高度保守的多功能系统,包括ESCRT-0,I,II,III复合体和Vps4-Vtal辅因子家族。ESCRT系统在内体和多泡体形成,胞质分裂时的膜切割等一系列膜重构过程中起关键作用,同时在miRNA的活性调控等方面具有重要的作用。多泡体的形成与病毒出芽分泌、外泌体分泌、特定细胞内板层小体的形成等多种细胞生理活动相关。U18666A是一种细胞通透性的两亲性氨基类固醇,最初作为抑制胆固醇合成治疗药物上市,后因严重副反应退市。目前研究发现U18666A是细胞内胆固醇转运的抑制剂,能够抑制胆固醇由溶酶体向晚期内体以及反面高尔基网的转运,造成细胞溶酶体内胆固醇积聚,细胞的病理改变与NPC-1突变导致的C型尼曼匹克病（Niemann-Pick disease）相似。在二型肺泡上皮细胞中,U18666A还促进胆固醇在的标志细胞器板层小体（lamellar body）积聚,这是和NPC-1相关的。U18666A能够干扰细胞内多泡体的形成,抑制HIV、丙肝病毒（Hepatitis C virus（HCV））等病毒以出芽方式释放出细胞。U18666A所参与调控的多泡体相关的功能与ESCRT系统有所重叠。U18666A所引发的细胞生理现象与ESCRT系统的关系是一个值得深思的问题。本研究使用分别过表达ESCRT-Ⅲ复合体成员Chmp1b和Vps24的转基因MLE12细胞系作为材料,对比正常MLE12细胞以及转空载体的细胞,检查了U18666A诱发转基因细胞胆固醇积聚能力的变化,分析了U18666A对转基因细胞生存能力的影响,对U18666A和ESCRT系统的调控关系做了初步探讨。研究方法:本研究使用U18666A诱导MLE12细胞,由于大剂量的U18666A会造成细胞凋亡,所以我们用不同浓度的U18666A诱导MLE12细胞。应用Western Blot技术检测,使用药物浓度为0.5μg/mL,1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,6μg/mL时,观察ESCRT系统成员Vps4,Vps24,Chmp1b表达量的变化。为了检测药物U18666A干扰后ESCRT系统各成员的分布情况,我们使用免疫荧光检测。在这里我们检测了药物U18666A干扰后MLE12细胞与对照组相比,Chmp1b蛋白的分布情况。我们对1μg/mL U18666A干扰24h后的MLE12细胞和加入DMSO的对照组采用流式细胞技术检测,与对照组相比,干扰组G2/M期细胞增多,出现了G2/M期细胞阻滞。为了进一步探讨U18666A和ESCRT系统的调控关系,我们分别建立了过表达Vps24,Chmp1b的转基因细胞系,应用western blot技术检测带有myc-his标签的Vps24,Chmp1b的表达情况,得到正确的过表达转基因细胞系。分别取MLE12细胞,MLE12-VPS24细胞,MLE12-CHMP1B细胞,MLE12-VECTOR细胞。浓度效应:每一种细胞系的实验组加入终浓度为0.1,0.2,0.4,0.8μg/mL的U18666A,对照组加入相同体积的DMSO。诱导后观察各细胞的胆固醇储积情况。时间效应:各细胞系加入终浓度为0.5μg/mL的U18666A,于药物诱导4h,8h,16h后,观察各细胞的胆固醇的储积情况。分别取MLE12细胞,MLE12-VECTOR细胞,MLE12-VPS24细胞,MLE12-CHMP1B细胞,0.4%的Trypan Blue,细胞计数仪TC20计数,比较各细胞在各时间点的细胞存活率的差异。结果:通过不同浓度的U18666A处理MLE12细胞48h后收集蛋白做western blot可以观察到,随着U18666A浓度的升高,ESCRT系统成员中的Vps4,Vps24,Chmp1b相对β-tubulin的总体趋势是降低的。我们对2μg/mL U18666A干扰48h后MLE12细胞进行了免疫细胞荧光染色。与对照组相比,U18666A诱导组细胞Chmp1b在细胞核和浆中都有分布。对U18666A干扰后的MLE12细胞,进行流式细胞术检测,与对照组相比,观察到实验组细胞出现G2/M期的阻滞。我们通过western blot技术检测两种过表达Chmp1b,Vps24的MLE12的稳转细胞系。采用终浓度为0.1,0.2,0.4,0.8μg/mL的U18666A分别处理MLE12,MLE12-VECTOR,MLE12-VPS24,MLE12-CHMP1B细胞系。结果显示,MLE12细胞和MLE12-VECTOR在U18666A浓度为0.2μg/mL时已经出现明显的胆固醇积聚,而MLE12-VPS24和MLE12-CHMP1B在U18666A浓度为0.4μg/mL,才有明显积聚。采用终浓度为0.5μg/mL的U18666A分别处理MLE12,MLE12-VECTOR,MLE12-VPS24,MLE12-CHMP1B细胞系。结果显示,MLE12细胞和MLE12-VECTOR在U18666A干扰第8h时即可出现胆固醇的积聚,而MLE12-VPS24和MLE12-CHMP1B在U18666A干扰8h时,很少有胆固醇的积聚。16h后才有胆固醇的积聚。分别于24h,48h,72h回收计数各组细胞,分析显示各细胞系在U18666A处理后,存活率都会下降。但在72h时MLE12-VPS24,MLE12-CHMP1B细胞系存活率比MLE12,MLE12-VECTOR细胞系高。结论:U18666A干扰ESCRT系统的一部分功能,ESCRT系统与U18666A发挥生物学作用密切相关,使用U18666A处理MLE12细胞后转运必需的内体分选复合体（ESCRT）系统相关蛋白表达降低。ESCRT系统的对细胞内胆固醇转运是有影响的,从ESCRT系统入手,可以为研究C型尼曼匹克病病变机制提供新的思路。