流行性日本乙型脑炎（Epidemic encephalitis B）,简称乙脑,是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种人畜共患病,是威胁人类尤其是儿童健康的主要传染病之一。猪被认为是乙脑流行环节中的“放大宿主”,日本乙型脑炎病毒可在猪体内大量繁殖,从而引起明显的病毒血症。此外,日本乙型脑炎病毒还可以通过蚊子在猪群之间进一步传播,对中国养猪业造成重大经济损失。日本乙型脑炎的防控不仅需要疫苗的有效防疫,也需要简便、快捷、准确的诊断与检测。单克隆抗体（Monoclonal antibodies,Mc Ab）具有高度特异性的优点,基于单抗而建立的日本乙型脑炎抗原抗体诊断方法具有很大的应用前景。本研究进行了日本乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备及其抗原抗体检测方法的建立与初步应用。本研究建立了一种较为温和地纯化日本乙型脑炎病毒的双重凝胶层析方法,与病毒原液相比,双重凝胶层析纯化后日本乙型脑炎病毒的回收率和总蛋白去除率分别为61.04%和99.71%,HCP和BSA去除率分别达到98.72%和99.72%,表明在经过膜包超滤浓缩及琼脂糖凝胶分子筛层析（TFF-SEC）后,进一步进行Capto TMCore700层析能够获得纯度更高、完整性更好,且具有良好免疫原性和生物学活性的病毒颗粒。以TFF-SEC-Capto TMCore700纯化的日本乙型脑炎病毒粒子作为抗原,采用IPMA、IFA和间接ELISA相结合的手段,建立了日本乙型脑炎病毒单抗体外（Vero细胞系）筛选的试验方法。研究共筛选到5株单克隆抗体:29E3、29F8、4B4、2F2和36A6,其杂交瘤细胞培养上清效价在1:800～1:1600之间;接种小鼠后,制备的腹水效价在1:5.12×105～1:2.56×106之间。类和亚型鉴定表明,4B4和36A6为Ig G1类,29E3、29F8和2F2为Ig G2α类,29E3、29F8和2F2轻链为κ链,4B4和36A6轻链为λ链。稳定性测定试验表明,五株杂交瘤细胞均能稳定、持续分泌特异性抗体。Western blot鉴定结果显示,29F8和2F2单克隆抗体可以特异性识别JEV的E蛋白。应用纯化的日本乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体,制备了可用于检测日本乙型脑炎病毒的胶体金试纸。试纸条特异性强,检测极限约可达103～104TCID50/100μL,重复性、稳定性良好,可广泛应用于生产、临床上多种样品检测。研究进一步优化了各种检测条件,并对临床检测日本乙型脑炎病毒阴性、阳性血清临界值进行了判定,建立了日本乙型脑炎病毒单抗阻断ELISA检测方法,最低可检测到1:1600倍稀释的阳性血清,具有较强的特异性;批内、批间重复性试验的变异系数均小于5%。综上所述,本研究成功建立了日本乙型脑炎病毒单抗体外筛选方法,并获得5株能稳定、持续分泌特异性抗体的杂交瘤细胞;成功建立了日本乙型脑炎病毒单抗阻断ELISA检测方法。