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背景:2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)及肥胖人群中游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)及革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分-脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)水平虽然明显高于普通人群,但通常呈轻度增高。研究显示,高浓度的FFA或LPS可导致胰岛β细胞凋亡及功能障碍,而T2DM或肥胖人群中更常见的代谢性增高浓度的FFA或LPS对胰岛β细胞却无明显毒性作用。棕榈酸约占FFA的20%～35%,是FFA中与代谢紊乱密切相关的组分。近来发现,代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同通过激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)影响鞘脂信号通路,进一步促进免疫细胞炎症因子表达。大量资料表明,鞘脂分子除了作为细胞的膜性结构成分外,更是一关键的信号转导途径,能调控许多刺激原引起的细胞反应。本课题组的前期研究显示:鞘脂分子亦在调控T2DMβ细胞功能中起着重要作用,并初步发现代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同通过影响鞘脂分子代谢的关键酶-中性神经酰胺酶(neutral ceramidase,NCDase)蛋白表达损害胰岛β细胞活性。本文将进一步探讨代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同对β细胞凋亡和胰岛素分泌的影响以及TLR4、鞘脂分子在其中扮演的角色,为阐明细菌、脂毒性致T2DM的机制提供新的依据和防治靶点。目的:探讨代谢性增高的棕榈酸与LPS协同对β细胞凋亡及胰岛素分泌的影响及可能机制。方法:(1)大鼠胰岛素瘤INS-1细胞株经不同浓度的LPS(1、10、50 ng/m L)刺激24小时后,流式细胞术检测细胞凋亡率。(2)INS-1细胞用棕榈酸(0.125mmol/L,下同)单独、或者联合不同浓度的LPS(1、10、50 ng/m L)处理24小时后,流式细胞术检测细胞凋亡率以及Western blot检测Cleaved caspase-3表达。(3)采用棕榈酸和LPS(50 ng/m L,下同)单独或联合作用INS-1细胞24小时后,ELISA法检测胰岛素分泌。Western blot检测NCDase、TLR4蛋白表达;HPLC法检测NCDase活性及HPLC-MS/MS法检测神经酰胺(ceramide,Cer)和神经鞘氨醇(sphingosine,Sph)的含量。(4)观察转染p EGFP-C3-NCDase重组质粒后,棕榈酸联合LPS刺激的INS-1细胞凋亡率及胰岛素分泌功能的改变。(5)观察使用TLR4抑制剂TAK-242(1μmol/L)处理后,棕榈酸联合LPS刺激的INS-1细胞NCDase表达变化。(6)观察使用Cer合成酶抑制剂Fumonisin B1(25μmol/L)处理后,棕榈酸协同LPS刺激的INS-1细胞凋亡率及胰岛素分泌功能的改变。结果:(1)代谢性增高浓度的棕榈酸(0.125 mmol/L,下同)或LPS(1～50 ng/m L)单独对INS-1细胞凋亡无明显影响。(2)代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS(50ng/m L,下同)协同可显著增加INS-1细胞凋亡率及Cleaved caspase-3表达(P<0.05)。(3)代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同可明显抑制INS-1细胞基础胰岛素分泌(P<0.01),对葡萄糖刺激的胰岛素分泌及细胞内胰岛素含量无影响。(4)代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同显著抑制INS-1细胞内NCDase活性及表达(P均<0.05)。(5)高表达NCDase能明显缓解棕榈酸与LPS协同诱导的INS-1细胞凋亡和基础胰岛素分泌减少(P均<0.05)。(6)代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同增加INS-1细胞Cer并降低Sph的含量(P均<0.05)。(7)代谢性增高浓度的棕榈酸与LPS协同可上调INS-1细胞TLR4表达(P<0.05);而抑制TLR4表达可缓解棕榈酸联合LPS诱导的NCDase表达降低(P<0.05)。(8)抑制Cer从头合成不影响棕榈酸与LPS协同诱导的INS-1细胞凋亡和基础胰岛素分泌减少。结论:与高浓度FFA通过诱导Cer从头合成损害β细胞不同,代谢性增高浓度的FFA与LPS协同可通过激活TLR4信号,抑制NCDase活性,进而影响鞘脂分子代谢促进胰岛β细胞凋亡并抑制基础胰岛素分泌。