脓毒症是宿主对感染应答失调并可使患者生命受到威胁的器官功能障碍。近年来,虽然抗感染、营养支持、器官功能维护等脓毒症的综合治疗取得了长足的进步,但脓毒性休克的死亡率仍然高达70%。当前临床工作者对脓毒症更全面和深入的治疗仍然面临巨大挑战。研究表明,脓毒症时,巨噬细胞的葡萄糖代谢方式从三羧酸循环、氧化磷酸化向有氧糖酵解转变,后者是介导巨噬细胞免疫功能过度激活的关键机制,直接推动脓毒症病情进展。葡萄糖代谢的有氧糖酵解方式,为巨噬细胞快速释放大量炎症介质和细胞因子提供能量,并促进乳酸的进一步聚集,增加脓毒症患者的死亡率。研究表明,犀角地黄汤(XJDHT)治疗脓毒症临床效果显著,可显著改善脓毒症患者的预后,患者急性生理与慢性健康评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)及序贯器官衰竭评分(SOFA)均显著下降,抗生素的应用时间缩短。本研究拟通过体内外实验及临床试验相结合,观察犀角地黄汤对脓毒症模型大鼠及对脓毒症患者的整体效应及对局部炎症反应的影响;运用ELISA、RT-PCR、Western blot等分子生物学技术,观察犀角地黄汤对有氧糖酵解代谢的关键分子的影响,阐明犀角地黄汤调控TLR4/HIF1α/PKM2信号通路介导的巨噬细胞有氧糖酵解代谢的分子机制及具体作用靶点。研究目的[1]通过建立脓毒症大鼠模型,结合各种技术手段,阐明XJDHT治疗脓毒症的分子机制是否与抑制“TLR4/HIF1α/PKM2”信号通路、调控巨噬细胞有氧糖酵解代谢有关。[2]观察XJDHT对老年脓毒症患者病程进展中炎症介质和细胞因子释放的影响,并观察XJDHT与老年脓毒症患者预后的关联,初步明确XJDHT通过调控葡萄糖糖酵解,改善脓毒症患者预后的潜在的病理生理机制。[3]回顾性分析脓毒症患者有氧糖酵解的酶之一,乳酸脱氢酶与预后的关系,初步阐明糖代谢重编程调控脓毒症患者预后的机制,评价影响脓毒症预后的独立危险因素。研究方法[1]建立脓毒症大鼠模型,观察大鼠一般状况、生命体征,阐明XJDHT对脓毒症大鼠模型整体效应的影响;从炎症介质水平,观察XJDHT对炎症反应的影响;从有氧糖酵解中间产物、关键酶和三羧酸循环中间产物的变化,观察XJDHT对肺泡巨噬细胞葡萄糖代谢方式的影响;从有氧糖酵解信号通路中关键分子的指标变化,明确XJDHT对肺泡巨噬细胞有氧糖酵解的调控机制。[2]选择连续收住入院的老年脓毒症患者共计63例,将入选患者应用随机表法随机分为中药治疗组(试验组)32例和对照组31例,两组患者自入组开始均给予脓毒症的常规治疗,中药治疗组(实验组)在常规治疗基础上给予XJDHT浓缩水煎液100 ml 口服或鼻饲,对照组给予等量生理盐水,均每日1次,连续治疗1个疗程共7d。比较两组患者入组后第1、3、7、14d血清白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、乳酸水平的差异,并观察两组ICU住院率、ICU住院时间及28 d病死率,Kaplan-Meier生存曲线分析两组28 d生存率的差异。[3]回顾性分析收住入院的192例脓毒症患者的临床资料,根据患者入住重症医学科时首次乳酸脱氢酶(LDH)检验结果,将患者分为LDH正常组(LDH<225u/l)和LDH升高组(LDH≥225u/l),观察LDH与其他指标如白介素-1、乳酸、氧合指数、肌酐等的相关性,观察脓毒症患者的死亡危险因素,观察LDH水平与28天死亡率的关系,评价LDH预测脓毒症28天死亡率的效能。研究结果[1]XJDHT大剂量组第5、7天IL-1β水平与脓毒症模型组、E5564组相比均有统计学差异;XJDHT小剂量组第5、7天IL-1β水平与脓毒症模型组、E5564组相比均有统计学差异。脓毒症模型组第3、5、7天血清IL-6水平与空白组相比较有显著统计学差异;XJDHT大剂量组第5、7天TNF-α与脓毒症模型组相比有显著统计学差异。XJDHT大剂量组第5、7天与脓毒症模型组相比有显著统计学差异。[2]XJDHT大剂量组第5、7天血糖水平与模型组有统计学差异。脓毒症模型组大鼠第3、5、7天的血清乳酸水平与空白组相比有显著统计学差异,XJDHT大剂量组第5、7天乳酸水平与模型组大鼠相比均有显著统计学差异,XJDHT小剂量组第5天乳酸水平与模型组相比有统计学意义,第7天乳酸水平与模型组相比有统计学意义。[3]XJDHT大剂量组、XJDHT小剂量组己糖激酶mRNA及蛋白表达均较模型组表达下调,XJDHT大剂量组磷酸果糖激酶mRNA及蛋白表达较模型组表达下调,XJDHT大剂量组M2型丙酮酸激酶mRNA及蛋白表达较模型组表达显著下调。[4]XJDHT大剂量组TLR4 mRNA及蛋白表达较模型组表达显著下调,XJDHT小剂量组TLR4 mRNA及蛋白表达下调较脓毒症模型组轻度下降,XJDHT大剂量组NF-κB mRNA及蛋白表达较模型组表达显著下调,XJDHT小剂量组TLR4 mRNA及蛋白表达较脓毒症模型组下调不明显。XJDHT大剂量组、XJDHT小剂量组HIF1α mRNA表达较模型组表达均显著下调。[5]将老年脓毒症患者分为对照组及实验组(犀角地黄汤组),结果表明,两组患者第1、3、7天血清IL-1β水平无统计学差异,第14天血清IL-1β水平有统计学差异;两组患者第1、3天血清炎症介质IL-6水平亦无统计学差异,而两组第7天血清IL-6水平有统计学差异,两组第14天血清IL-6水平差异进一步扩大,具有显著统计学差异;两组患者第7天和第14天血清炎症介质TNF-α水平有显著统计学差异;两组患者第3、7天血清乳酸水平可见显著统计学差异;比较两组患者预后发现,两组患者重症医学科(ICU)住院率、ICU住院时间和28天死亡率均有显著统计学差异。[6]回顾性分析入住重症医学科的脓毒症患者资料发现,脓毒症患者血清LDH水平与肌酐、IL-1β、乳酸呈显著正相关,与氧合指数呈显著负相关;LDH升高组的急性呼吸窘迫综合征、急性肾损伤、脓毒性休克等脓毒症相关的器官功能障碍的发生率高于LDH正常组;相应地,两组接受机械通气、连续肾替代治疗(CRRT)及血管活性药物的比例亦有统计学差异。LDH升高组患者的28天死亡率高于LDH正常组,LDH是脓毒症患者的死亡独立危险因素,并且是预测28天死亡率的较好指标。研究结论[1]脓毒症时,巨噬细胞葡萄糖代谢方式由三羧酸循环向有氧糖酵解转变,犀角地黄汤可通过抑制TLR4/HIF1α/PKM2信号通路,下调巨噬细胞有氧糖酵解代谢,从而抑制炎症介质和细胞因子的瀑布样释放,减少乳酸聚集,阻止脓毒症进程。[2]犀角地黄汤可降低老年脓毒症患者血清IL-1、IL-6、TNF-α等多种炎症介质及乳酸水平,降低转入重症医学科的患者比例,缩短患者在重症医学科的住院时间,并降低老年脓毒症患者的28天全因死亡率。[3]作为有氧糖酵解过程中重要的酶之一,血清LDH是脓毒症患者死亡的独立危险因素,且与患者28天死亡率增高有显着相关性。血清LDH水平与血清乳酸,IL-1β,肌酐水平呈显著正相关关系,与氧合指数呈显著负相关关系。当脓毒症患者血清LDH水平升高时,脓毒症相关的器官功能障碍如急性呼吸窘迫综合征、急性肾损伤、感染性休克等的发生率明显增加。非存活组患者的血清乳酸和IL-1β等炎症介质水平较存活组显著升高。血清LDH是预测脓毒症患者28-天死亡风险的有价值的指标。