副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)是一种广泛分布于海产品中的致病菌,被食用后能引起人的腹泻、呕吐等症状。它已被证实能够进入活的非可培养状态(viable but non culturable,VBNC)。VBNC状态是细菌应对外界环境压力时采取的一种自我保护的生存机制,处于这种状态下的细菌不能通过平板培养法检测,但其仍然具有代谢活性甚至致病性,且当外界条件适宜时能被复苏成正常状态的细菌。因此,副溶血弧菌的VBNC状态的研究对食品质量检测、疾病预防控制具有重要意义。本文采用不同诱导条件诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,并对诱导过程中的菌数变化进行监控。采用多种复苏方式对不同诱导条件下的VBNC菌进行复苏,考察诱导条件对复苏的影响以及不同复苏培养基的复苏效果。探究了生物膜形成与VBNC状态之间的联系。建立了PMA-qPCR检测方法用于定量检测处于VBNC状态的副溶血弧菌。分析了副溶血弧菌的生理特性。并利用转录组和蛋白质组比较了副溶血弧菌VBNC状态和复苏状态与正常状态中的基因和蛋白的差异表达。本研究为副溶血弧菌VBNC状态的检测及其形成机制的研究提供了重要的理论方法和数据支持。研究的主要内容及结果如下:1、采用不同的温度、盐浓度和氯霉素浓度共12种条件诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,其中7种条件下副溶血弧菌在60 d内进入了VBNC状态。采用PMA-qPCR技术定量检测副溶血弧菌活菌数并计算出VBNC细胞的浓度。VBNC细胞终浓度最低为5×10~2 CFU/mL,最高为1.7×10~5 CFU/mL。此外,大蒜提取物和肉桂提取物亦能成功诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,且比氯霉素的效率更高。2、不同诱导条件下的VBNC状态菌,对不同的复苏培养液敏感。其中4℃诱导的VBNC状态菌能被最多的培养液复苏,复苏能力最强。1%吐温80能复苏除诱导条件是2 MIC大蒜提取液以外的所有菌,复苏效果最好。利用无菌上清培养液能快速将VBNC状态菌复苏,而热处理后会对复苏效果产生影响。3、采用结晶紫染色法半定量检测VBNC诱导过程中生物膜的形成情况。研究发现,在这一过程中,菌液未进入VBNC状态的实验组比进入VBNC状态的实验组能生成更多的生物膜。比较了副溶血弧菌生物膜与浮游菌诱导VBNC状态的情况,实验证明在相同的诱导条件下,浮游菌比生物膜细菌更容易进入VBNC状态。4、基于副溶血弧菌tlh基因设计引物,优化PMA处理条件(PMA避光处理5 min,卤钨灯曝光15 min),建立了针对副溶血弧菌的PMA-qPCR检测技术。检测范围在1.2×10~2至1.2×10~9CFU/mL。结果表明,利用PMA-qPCR检测技术能够方便准确地定量监控诱导过程中活菌数的变化及VBNC状态菌的形成情况。5、利用LIVE/DEAD细胞试剂盒在荧光显微镜下区分活细胞与死细胞,以确认VBNC状态细胞的存在。将传统的CTC呼吸实验与激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞分析技术结合,采用CTC/DAPI双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。证实了处于VBNC状态的副溶血弧菌仍然具有呼吸活性。6、在转录组和蛋白质组水平比较分析副溶血弧菌的VBNC状态和复苏状态与正常状态中的基因和蛋白的差异表达。三组(正常与复苏,正常与VBNC,VBNC与复苏)间的总差异表达基因数为1309个。三组间总差异蛋白546个。VBNC状态的差异表达基因主要表现在代谢过程、金属离子传递、运动、刺激反应、信号传递、抗氧化、运输等;差异蛋白主要参与核糖体合成、氨基酸代谢、碳固定、脂肪酸合成与代谢等过程。复苏状态的差异表达基因主要表现在核糖体合成、蛋白质翻译、脂肪酸合成与代谢、HIF-1信号通路等过程中;差异蛋白主要作用于ABC转运子(跨膜运输)。