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背景:Salehi在2000年通过酵母双杂交系统发现了NRAGE,它能够与p75NTR相互作用,属于MAGE(黑色素瘤相关抗原基因)-D亚族的成员。此外,因为它又能够与转录调控因子如Dlx5等相互作用,所以被命名为MAGE-D1或Dlxin-1。研究表明,NRAGE在细胞凋亡、细胞的转录调节、细胞周期与细胞增殖、肿瘤的发生发展与转移中举足轻重。目的:NRAGE在很多肿瘤组织中的表达量是下降的,属于潜在的抑癌基因。然而我们实验室的前期研究发现,相对于正常肝细胞和癌旁组织,NRAGE基因在肝癌细胞和肝癌组织中异常地高表达,这提示我们NRAGE在肝癌中可能存在着有别于其他种类肿瘤细胞的特殊调节机制。自噬能够抑制肿瘤的发生发展,肝癌细胞与正常肝细胞相比,自噬水平普遍降低。我们的前期研究还发现,在NRAGE敲除小鼠胚胎成纤维细胞中,自噬水平显著提高。因此我们推测,NRAGE的高表达可能与肝癌细胞中自噬水平的降低有关。Beclin 1与Ⅲ型PI3K激酶结合形成PI3KC3复合物,PI(3)P是Ⅲ型PI3K激酶的产物,能将一些蛋白质募集到自噬前体结构(PAS),还能激活两个泛素样蛋白结合系统,促进自噬前体延伸、闭合形成自噬体,二者对自噬的起始至关重要。我们的合作研究小组发现,NRAGE能够与Beclin 1结合,故研究者猜想NRAGE是否能够通过抑制Ⅲ型PI3K激酶的活性来抑制自噬。PI(3)P是Ⅲ型PI3K激酶的产物,我们可以通过检测细胞中PI(3)P的含量来间接反映Ⅲ型P13K激酶的活性,而要检测PI(3)P的含量必须首先构建重组质粒pGEX-6p-1-p40phox-PX并且原核表达重组蛋白GST-p40phox-PX。这是因为p40phox蛋白的PX结构域能特异性地结合PI(3)P。做好准备工作后,接下来就要探讨本课题中的核心问题:干扰NRAGE基因的表达对人肝癌细胞HepG2自噬以及Ⅲ型PI3K激酶的活性的影响;NRAGE在HepG2细胞中对自噬的这种作用及机制是否也适应于正常细胞,如293细胞。方法:1、构建pGEX-6p-1-p40phox-PX重组质粒:以thp-1细胞的cDNA为模板,PCR扩增人源p40phox-PX基因;EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切目的基因和载体pGEX-6p-1后,用T4 DNA ligase连接过夜;连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,进行菌落PCR和电泳鉴定;测序、比对。2、原核表达、纯化GST-p40phox-PX重组蛋白:将重组质粒转化至BL21或Rosetta(DE3)感受态细胞,涂布于LB固体培养板上;挑单克隆到LB液体培养基中培养14h;按1%的比例接种,IPTG诱导重组蛋白的表达。按上述步骤,摸索蛋白表达量较高及可溶性的条件。在适宜条件下,大量诱导表达重组质粒,用GST纯化系统纯化重组蛋白。3、设计并合成2条siRNA小片段,转染HepG2细胞以干扰NRAGE基因的表达,采用Western blot检测NRAGE蛋白的表达和自噬标志分子LC3BⅡ/Ⅰ的变化;采用protein-lipid overlay assay检测PI(3)P的含量来间接检测Ⅲ型PI3K激酶的活性。也就是说:从35mm小皿中抽提细胞脂质,点样至PVDF膜,风干过夜,用封闭液孵育膜1h后,加入GST-p40phox-PX蛋白孵育过夜,用抗GST抗体检测。4、100nM siRNA转染293细胞,采用Western blot检测NRAGE蛋白的表达和LC3BⅡ/Ⅰ含量的变化;采用protein-lipid overlay assay检测PI(3)P的含量。结果:1、将阳性克隆菌液送去公司测序,测序结果在NCBI上进行比对,相似性100%,表明成功地构建了 pGEX-6p-1-p40phox-PX重组质粒。2、无IPTG的对照组及空载没有蛋白表达,只有IPTG诱导的重组质粒组有明显的蛋白条带,且分子量与理论值相符,表明此处为目的蛋白。在0.1 mM IPTG、1 8℃、220rpm条件下诱导表达18h,此时重组蛋白主要以可溶形式存在于上清液中。纯化后的蛋白产物有一条特异的条带,表明成功地纯化出GST-p40phox-PX 重组蛋白。3、siRNA转染HepG2细胞48小时后,NRAGE蛋白含量下降,说明NRAGE基因的表达被干扰;自噬标志蛋白LC3BⅡ/Ⅰ比值增大,说明自噬增强;PI(3)P的含量增加,说明Ⅲ型PI3K激酶的活性增强。4、siRNA转染293细胞48小时,NRAGE基因的表达被干扰后,自噬增强,Ⅲ型PI3K激酶的活性增强。结论:NRAGE能够通过抑制Ⅲ型PI3K激酶的活性来抑制细胞的自噬,有关深入的分子机制有待进一步研究。