组蛋白甲基转移酶EZH2是表观遗传学领域中的抗瘤靶点,许多抑制剂已经进入临床实验阶段,因此针对EZH2活性抑制剂的研究具有重要的生物医学应用价值。本论文利用NF-κB特异性启动子DMP和靶向EZH2的miRNA共同构建10个干扰载体,来调控细胞内EZH2的活性。主要研究内容如下:选择EZH2作为靶点,设计并合成10对靶向EZH2编码区的人工miRNA单链寡核苷酸,将其退火后连入含有鼠源miR-155骨架的通用干扰载体pEASY-Blunt-DMP-miRlac,构建10个靶向EZH2的干扰载体,同时使用pEASY-Blunt-DMP-miR-Neg作为阴性对照载体。制备编辑载体TALENs和重组同源臂用于后续干扰效果评价。细胞转染实验证明本实验构建的10个干扰载体均能不同程度的促进癌细胞凋亡。将各组干扰载体转染HepG2细胞,提取细胞总RNA,反转录形成cDNA,使用qPCR检测细胞内EZH2的转录水平,结果显示本实验构建的干扰载体能够上调靶基因的mRNA。流式细胞检测技术检测细胞凋亡率,从10个干扰载体中筛选出最高效干扰载体pDMPEZH2-miR1741。为进一步探究pDMP-EZH2-miR1741对靶基因蛋白水平的影响,将pDMP-EZH2-miR1741分别转染PANC-1和HepG2细胞,转染48h后提取总蛋白质进行Western blot分析。结果显示pDMP-EZH2-miR1741能够显著降低靶蛋白的表达;同时,本实验利用基因编辑技术TALENs在EZH2上融合了绿色荧光蛋白基因ZsGreen,TALENs与pDMPEZH2-miR1741载体共转染HepG2细胞。通过荧光显微镜拍照和流式细胞检测荧光强度,发现经pDMP-EZH2-miR1741干扰后,细胞荧光强度下降,这与Western blot结果一致,表明pDMP-EZH2-miR1741能够下调靶蛋白的表达。用最高效的干扰载体pDMPEZH2-miR1741分别转染HepG2、PANC-1、A549和HL7702细胞,CCK-8试剂处理后使用酶标仪检测细胞生长情况并绘制生长曲线,结果显示pDMP-EZH2-miR1741能够很好的抑制癌细胞的生长,而对正常细胞活力几乎没有影响。因此,本实验筛选出的pDMP-EZH2-miR1741载体有望成为靶向EZH2基因的新型表观抗癌剂,用于癌症的基因治疗。