论文部分内容阅读
凝结芽孢杆菌是一种从土壤中分离的可以形成芽孢的革兰氏阳性菌,该类微生物1915年被Hammer等人首先发现。作为一种工业微生物,它具有很多良好的工业发酵特性,例如可以在50~55°C温度条件下,稳定高效的生产高光学纯度的L-乳酸。另外,凝结芽孢杆菌作为一个物质转化平台,可以将可再生的生物质资源转化为不同的高值化合物。而较高的发酵温度又可以进行开放式发酵并且培养基无需灭菌,大大降低了生产的动力成本。除了可以生产平台化合物,凝结芽胞杆菌还可以生产多种耐热酶和凝结素等工业产品。近期研究表明凝结芽胞杆菌可以作为一种安全的益生菌,添加到动物饲料中。与其它益生菌相比,凝结芽胞杆菌具有可以耐受较低的pH和较高的温度等特点。尽管凝结芽孢杆菌很早就被人们所发现,但是与其相关的研究和背景知识很少,而且遗传信息也不清楚。随着高通量测序技术的发展,测序成本越来越低,使得凝结芽胞杆菌全基因组测序成为可能。在本文中,我们通过结合Solexa测序和第一代Sanger测序技术,首次完成了凝结芽胞杆菌2-6菌株的全基因组测序工作,并得到了完整的基因组图谱。另外,利用高通量测序技术对其它4株凝结芽胞杆菌(XZL4,XZL9,DSM1和H-1)的全基因组进行测序得到了基因组草图。在全基因组信息基础上,我们对凝结芽胞杆菌进行横向和纵向的比较基因组和功能基因组的分析。分别从其进化地位,碳水化合物代谢,微生物免疫系统,细胞壁合成和物质转运系统等角度分析凝结芽胞杆菌优秀的工业发酵特性。通过进化分析,我们确定了凝结芽胞杆菌的进化地位,表明其可能与地芽孢杆菌来自同一个祖先。我们分析了整个凝结芽胞杆菌木糖代谢途径,阐述了不同菌株之间木糖代谢能力不同的原因,并发现了一个新的木糖异构酶。在细胞壁合成过程中,新的融合基因的存在提高了壁磷壁酸合成效率,可能增强了细菌耐受高温的能力。在凝结芽胞杆菌中存在的免疫系统和限制性修饰系统为该菌提供了抵抗噬菌体和其它外源遗传物质的能力。根据分子进化理论,微生物在进化适应环境的过程中,一些具有正向选择压力的关键基因为生物提供了竞争上的优势,例如抗逆或者致病基因等。为了探究凝结芽孢杆菌中抗逆机制,我们建立了一套计算正向选择压力的方法。该方法首先利用序列比对的原理确定基因组之间的直系同源基因,然后利用最大似然法计算同源基因之间的非同义突变和同义突变频率的比值。这个比值作为衡量正向选择压力的标准,可以确定在进化过程中提供竞争优势的基因。在分析芽孢杆菌基因组过程中,以凝结芽胞杆菌为研究对象,确定了与氨基酸代谢相关的基因具有较强的进化压力且显著富集,这些基因可能与凝结芽胞杆菌较强的环境适应性有关。利用链特异性RNA-Seq测序技术,研究凝结芽胞杆菌不同温度条件下基因表达谱的差异和转录调控的变化。通过差异基因分析,获得在高温条件下共有170个存在显著差异的基因,其中64个基因表达下调,106个表达上调。根据功能聚类分析确定了与氨基酸代谢相关的途经中表达下调基因占据重要地位,其中嘌呤合成基因受到了强烈抑制作为凝结芽胞杆菌生长的限制因素,为解释该菌的耐热机制提供了重要线索。最后,利用非标记蛋白质组技术确定了不同温度条件下蛋白质表达水平变化情况。利用iBAQ定量技术,我们共得到了275个差异蛋白质,35个蛋白质与转录组中的数据变化相吻合,其中包括嘌呤合成基因,分子伴侣蛋白和热应激蛋白等。从蛋白组水平证明了高温条件下凝结芽胞杆菌的耐热机制。另外,通过功能富集和调控模式分析,表明这两组数据中碳水化合物代谢相关蛋白表达量都明显上升。综上所述,本文系统的分析工业生产菌株凝结芽胞杆菌的基因组组成和进化历程等方面,与其它芽孢杆菌进行深入的比较分析。通过转录组,蛋白质组等手段,证明在高温条件下,凝结芽胞杆菌2-6进化出的独特的基因组结构和氨基酸合成途径,特别是嘌呤合成基因,对该菌的耐热性起到了重要的调控作用。