论文部分内容阅读
酶抑制法是当前农药快速检测的主流方法之一。在实验室前期工作中,我们发现,重组家蚕II型乙酰胆碱酯酶（rBmAChE2）对有机磷农药和氨基甲酸酯农药均表现出良好的敏感性,提示其可能作为一种用于农药快速检测的新酶源。为进一步了解该酶的晶体结构特征以便为后期的分子进化提供理论基础,需要制备高纯度的酶蛋白,为此本论文在对家蚕II型乙酰胆碱酯酶基因及蛋白序列生物信息分析的基础上,分别选取大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统,通过尝试不同的表达策略、优化分离纯化方法等开展高纯度酶蛋白制备研究,为后期酶工作机制的理论研究等应用方面奠定基础,主要研究内容及结果如下:（1）BmAChE2的生物信息学分析利用NCBI、PDB、SignalP 4.1 Server、Transmembrane Prediction server、ExPASy Proteomics tools、Phyre2等数据库和在线服务器及相关软件,从核酸序列分析,一级、二级、三级结构预测,同源性比对等方面对BmAChE2进行生物信息学分析。结果显示,BmAChE2基因片段大小为1917 bp,由638个氨基酸组成,分子量为71645.66 Da,分子式为C3254H4912N830O937S31,其中含有大肠杆菌稀有密码子48个,理论等电点为5.49,其中酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基各有70个,占10.97%。蛋白的N端存在一个由23个氨基酸组成的信号肽,C端有一个由17个氨基酸组成的疏水尾,分析其二级结构,无规卷曲含量达到50%,α螺旋占36%,β折叠占11%,TM螺旋占3%。其中TM螺旋刚好在C末端,与“DAS”预测的C端疏水尾结果一致。此外,发现BmAChE2氨基酸序列中含有9个Cys,形成了4对分子内二硫键和1个分子间二硫键。还有3个潜在的N-糖基化位点,分别是N138,N321,N522,均位于BmAChE2结构表面,且远离活性峡谷。进而,将BmAChE2的氨基酸序列与PDB中公布的其他来源的AChE的氨基酸序列进行同源比对。发现BmAChE2与果蝇AChE同源性相对较高,达50%,且BmAChE2的N端信号肽和C端疏水尾部分在其他已经结晶的AChE的两端并不存在,提示这两部分对于AChE三级结构的维持可能不是必须的。（2）BmAChE2在大肠杆菌中的表达根据对BmAChE2生物信息学分析结果,以稀有密码子、二硫键形成以及蛋白的可溶性为BmAChE2在大肠杆菌中表达的主要考虑因素,探究不同表达策略的作用。通过选用Transetta（DE3）作为宿主菌降低稀有密码子对表达的影响;通过与PDI共表达以及选用大肠杆菌Origami2为宿主菌促进目的蛋白二硫键的形成;通过去除BmAChE2片段中的信号肽和疏水肽,利用PelB信号肽促进分泌,与MBP、GST标签蛋白融合表达以及选取大肠杆菌Origami2作为宿主菌来促进目的蛋白的可溶性表达。最终分别构建了4种表达载体（pET22b-Bmace2、pET30b-Bmace2/pBAD-myc-hisA-PDI、pGEX-4T-1-Bmace2、pMAL-P2E-Bmace2）,选用了3种表达宿主菌（BL21（DE3）、Transetta（DE3）、Origami2）对BmAChE2进行诱导表达。结果显示,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,仅载体与宿主组合为pGEX-4T-1/Origami2时,胞内有少许可溶性目的蛋白产生,经Ni柱纯化发现纯化蛋白得率较低。进而优化包涵体表达的条件,确定在IPTG浓度为0.3 mM,18℃诱导30 h时,表达量最高。经复性、变性后,纯度达到90%以上,但经鉴定发现,重组蛋白没有乙酰胆碱酯酶活性。（3）BmAChE2在毕赤酵母中的表达对前期已获得的BmAChE2毕赤酵母表达工程菌株pPIC9K-ace-opt-GS115,进行诱导表达,并优化了BmAChE2的纯化条件。经过Ni柱、Q柱、SEC柱三步纯化之后,目的蛋白保留了乙酰胆碱酯酶活性,比酶活为2300 U/mg。但SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白具有严重拖尾现象。将纯化的目的蛋白经PNGase F处理后,拖尾消失,提示N-糖基化修饰可能是造成了拖尾的原因。进而根据预测的N-糖基化位点,选取N321,N522两个位点进行突变。构建突变重组载体pPIC9K-ace-opt-M23（N321Q,N522Q）后,转入毕赤酵母GS115基因组,筛选得到重组突变株pPIC9K-ace-opt-M23-GS115。经甲醇诱导表达后,取上清并经Ni柱纯化。参照Ellman法测定纯化目的蛋白活性,发现该重组BmAChE2/M23保留乙酰胆碱酯酶活性,比酶活为1137.33 U/mg,表明N321Q和N522Q糖基化突变后,BmAChE2/M23保留了乙酰胆碱酯酶活性。同时,经SDS-PAGE分析发现,突变后的BmAChE2/M23拖尾现象消失,目的蛋白纯度在90%以上,达到结晶蛋白纯度要求。