论文部分内容阅读
研究背景:原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生存健康。据2018年发布的全国癌症统计报告显示,我国肝癌新增死亡人数约31.8万,占癌症死亡率第二位。目前,针对肝癌治疗的传统药物中,化学药物毒副作用大及耐药性强,治疗后期患者的生存质量没有得到有效的提升。因此,开发研究新的高效低毒的抗癌药物有一定的现实意义。目前,天然产物的开发研究成为抗肿瘤研究的热点。人参皂苷Compound K(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol;CK)为二醇型人参皂苷在微生物中的代谢产物及最终活性成分。有关人参皂苷CK抗肿瘤研究已有报道,但在肝癌中的作用及机制尚不全面,因此深入研究人参皂苷CK对肝癌的抑制作用及相关分子机制对其进一步开发和利用有重要的意义。信号传导与转录激活因子 3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3,STAT3)在恶性肿瘤中高度活化,参与调控细胞的生长,凋亡及多种信号通路的转导。内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)反应是细胞为了缓解内质网中非正常蛋白积累造成的压力而形成的一种应答方式。当ERS过强或持续时间过长,超出了自身调节能力时,就会引起细胞凋亡。因此,STAT3和ERS相关的凋亡与抗肿瘤机制研究密切相关。研究目的:本研究通过体外细胞实验及体内裸鼠移植瘤实验,检测人参皂苷CK对肝癌细胞生长的抑制作用,探讨人参皂苷CK对STAT3活性、ERS及细胞凋亡的影响,同时检测人参皂苷CK调控STAT3影响ERS及细胞凋亡作用的分子机制,为人参皂苷CK的研究和开发提供理论基础。研究方法:1.体外实验:通过MTT法检测人参皂苷CK对不同肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh7及正常肝细胞L02增殖的影响;应用平板克隆实验检测人参皂苷CK处理肝癌细胞后的集落形成;利用Hoechst染色及流式细胞术检测人参皂苷CK对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的影响;利用免疫细胞化学及免疫荧光技术检测p-STAT3、STAT3的蛋白表达及定位;采用EMSA实验检测人参皂苷CK对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中STAT3与其靶DNA的结合活性;采用Western Blot检测肝癌细胞中凋亡相关蛋白、p-STAT3、STAT3及ERS相关蛋白的表达情况;此外,应用CRISPR/Cas9技术敲除STAT3基因及STAT3过表达质粒转染细胞,Western Blot法验证HepG2及SMMC-7721中STAT3的敲除和过表达效果以及进一步验证人参皂苷CK通过STAT3对ERS及细胞凋亡的调控作用。2.体内实验:建立人肝癌SMMC-7721细胞系裸鼠移植瘤模型,分为模型对照组,人参皂苷CK 5,10,20 mg/kg给药组。定期称量裸鼠体重,连续给药15天后,取出移植瘤,统计瘤重及体积,计算抑瘤率;采用HE染色、TUNEL染色,免疫组织化学法及Western Blot法检测STAT3表达、细胞凋亡和ERS相关蛋白的表达。研究结果:1.体外实验:MTT结果显示,人参皂苷CK能够抑制HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh7细胞的增殖,且呈现一定的浓度、时间依赖性;同时,在24h,48h时,对正常肝细胞L02增殖的抑制作用较小。Western Blot检测表明,人参皂苷CK能够抑制上述四种肝癌细胞中p-STAT3的表达,其中对HepG2及SMMC-7721细胞的作用最显著;平板克隆结果表明,人参皂苷CK作用后,HepG2及SMMC-7721细胞的克隆集落形成能力明显下降;Hoechst染色及流式细胞术结果显示,人参皂苷CK诱导了 HepG2和SMMC-7721细胞凋亡;免疫细胞化学及免疫荧光检测发现,STAT3定位在细胞质中,p-STAT3定位在细胞核中,人参皂苷CK能够剂量依赖式地抑制HepG2和SMMC-7721细胞中p-STAT3的表达;EMSA结果显示,人参皂苷CK抑制STAT3与其靶DNA的结合,有剂量依赖性;Western Blot检测发现,人参皂苷CK可以上调细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3,Cleaved PARP和ERS相关蛋白 GRP78、CHOP、Cleaved caspase 4、p-PERK、p-IRE1、p-JNK、p-eIF2α的表达;此外,构建STAT3基因敲除和STAT3过表达HepG2和SMMC-7721细胞,检测发现与人参皂苷CK处理组比较,人参皂苷CK+STAT3基因敲除组中,ERS相关蛋白表达及细胞凋亡进一步增加;人参皂苷CK+STAT3过表达组中ERS相关蛋白表达及细胞凋亡降低,差异显著,说明STAT3参与调控人参皂苷CK诱导的ERS和细胞凋亡。2.体内实验:人参皂苷CK能够抑制裸鼠移植瘤的肿瘤重量和肿瘤体积,同时裸鼠的体重在5,10mg/kg剂量组中没有显著差异;HE及TUNEL染色表明,人参皂苷CK作用后,移植瘤中细胞坏死及凋亡数增多;免疫组织化学及Western Blot结果显示,ERS相关蛋白GRP78,CHOP,Cleaved caspase4蛋白表达在人参皂苷CK作用后增多,p-STAT3蛋白的表达减少。研究结论:1.通过在体内和体外检测发现,人参皂苷CK可以抑制人肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。2.人参皂苷CK能够抑制STAT3的磷酸化活化表达及STAT3与其靶DNA结合。3.人参皂苷CK能够诱导肝癌细胞发生ERS作用。4.人参皂苷CK能够通过抑制STAT3的磷酸化活化调控人肝癌细胞中ERS作用及细胞凋亡。