目的:乳腺癌是女性最常被诊断出的癌症,在女性癌症相关死亡原因中排名第一。越来越多证据表明,随着现代外科技术的不断进步和化疗药物的不断创新,乳腺癌的防治取得了重大进展,显著降低了世界发达地区乳腺癌的死亡率。但是对于进展期乳腺癌,患者的预后依旧很差,治疗的手段也很局限。发展早期诊断指标和新疗法将需要对癌症进展有更深入的分子理解,因此,探寻乳腺癌发生发展的分子机制及治疗靶点对治疗乳腺癌患者尤为重要。P21活化激酶（p21-activated Kinases,PAKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,由六个成员组成,根据不同的生化和结构特征分为两类,每类有三个成员。第一组包括PAK1、PAK2和PAK3,第二组包括PAK4、PAK5和PAK6。在第二组的三个成员中,PAK5（也称为PAK7）是最新发现的PAK家族成员,在细胞骨架微管稳定性和细胞存活的调节中起着不可或缺的作用。越来越多的证据表明,PAK5是一种致癌蛋白,与多种癌症有关,包括胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等。尽管这些研究表明PAK5是肿瘤进展中的关键因子,但其潜在的分子机制尚未完全阐明。线粒体是启动和执行凋亡的关键因素。当受到一系列外部信号的刺激时,线粒体释放凋亡诱导因子如AIF（apoptosis inducing factor）、核酸内切酶G和细胞色素c进入细胞质,并激活半胱氨酸蛋白酶依赖的（caspase-dependent）或半胱氨酸蛋白酶非依赖的（caspase-independent）途径诱导凋亡。在正常生理条件下,AIF定位在线粒体膜间隙发挥氧化还原酶及电子传递的功能。一系列证据表明,当细胞受到凋亡信号刺激时,钙依赖性半胱氨酸蛋白酶calpains可与其他半胱氨酸蛋白酶（即溶酶体组织蛋白酶）一起切割AIF,使其成为57k Da可溶性促凋亡蛋白AIF（成熟AIF）,并能够增加线粒体膜通透性使AIF从线粒体释放到细胞质并进入细胞核,与DNA结合导致染色质凝聚和DNA大片段化,从而诱导caspase非依赖途径的细胞凋亡。AIF从线粒体到细胞核这一过程受多种因素调控。然而,PAK5对AIF功能的影响尚未见报道,AIF对乳腺癌进展的临床影响尚不清楚。在本研究中,我们发现PAK5可以阻止AIF从线粒体释放,并通过磷酸化AIF减少其核移位来抑制caspase非依赖细胞凋亡的发生。重要的是,我们的研究表明,随着乳腺癌的发展,AIF核移位明显减少,这与PAK5在乳腺癌中高度表达密切相关。这些结果提示PAK5-AIF信号通路可能是治疗乳腺癌的一个新的潜在靶点。研究方法:为研究PAK5和AIF在乳腺癌临床组织样本中的表达以及与患者预后的相关性,首先通过TCGA数据库预测AIF在乳腺癌组织的表达量以及在TCGA、GSE31519数据库中预测AIF的总生存率。通过Western-Blot、免疫组化实验检测PAK5和AIF在乳腺癌临床病例中的表达,并分析它们之间表达的相关性以及与肿瘤分级之间的相关性。针对PAK5、AIF不同表达水平对乳腺癌病例进行生存分析。通过蛋白质免疫共沉淀实验以及GST-pull down实验鉴定PAK5与AIF之间的相互作用。免疫荧光实验检测PAK5与AIF在细胞中的共定位。为研究PAK5对AIF从线粒体释放的影响。首先通过免疫荧光实验以及提取线粒体蛋白检测PAK5对AIF在线粒体中定位的改变。提取线粒体蛋白检测线粒体中BCL2/Bax比例变化以评估PAK5对线粒体膜通透性的影响。JC-1染色和流式细胞术检测PAK5对线粒体膜电位的影响。为证明PAK5能够影响caspase非依赖细胞凋亡,首先通过流式细胞术检测PAK5对细胞凋亡的影响。加入caspase阻断剂Z-VAD-FMK和凋亡诱导剂后,Western Blot检测早期凋亡指标cleaved-PARP表达变化。为研究PAK5对AIF核移位调控的具体机制。首先通过GST-pulldown实验检测PAK5与AIF结合的具体结构域。核浆分离及Western Blot检测PAK5对AIF核浆定位的影响。为探究PAK5影响AIF核移位的具体机制,利用免疫共沉淀实验检测AIF与PAK5之间相互作用的位置、AIF与importins之间的相互作用以及PAK5对AIF与importins之间相互作用的影响。为证明PAK5对AIF核移位的影响依赖于磷酸化水平,首先我们通过生物信息学预测PAK5可能磷酸化AIF的位点,核浆分离及Western Blot检测Flag、AIF WT、AIF S202A、AIF T281A核移位的改变。磷酸化蛋白质谱及免疫共沉淀实验验证PAK5磷酸化AIF的T281位点。流式细胞术检测Flag、AIF WT、AIF T281A对细胞凋亡的影响。免疫共沉淀实验检测Flag、AIF WT、AIF T281A与PAK5、importins结合的强弱。克隆形成及CCK-8实验检测Flag、AIF WT、AIF T281A对乳腺癌细胞增殖的影响。利用裸鼠成瘤实验观察分析磷酸化的AIF对乳腺癌细胞增殖能力的影响。为研究PAK5与AIF核移位在临床上的相关性。在乳腺癌旁组织、乳腺良性病、乳腺癌组织中检测AIF的表达和定位,并分析AIF不同表达水平及定位与乳腺癌分级的相关性。通过免疫荧光检测乳腺癌旁组织、乳腺良性病、乳腺癌组织中PAK5与AIF共定位强弱。结果:1.PAK5与AIF在乳腺癌组织中高度表达且呈正相关。TCGA数据库预测AIF在乳腺癌组织中高表达。TCGA、GSE31519数据库预测AIF高度表达患者的总生存率低。Western-Blot、免疫组化实验检测PAK5和AIF在乳腺癌临床病例中高度表达,并且二者在乳腺癌组织中表达呈正相关。与肿瘤分级也呈正相关。生存分析发现PAK5与AIF高度表达的患者预后差。免疫共沉淀实验证实PAK5与AIF在细胞内存在相互作用。GST-pull down实验证实PAK5与AIF在细胞外直接结合。免疫荧光实验证实PAK5与AIF共定位在乳腺癌细胞质中。2.PAK5通过调节线粒体膜通透性和膜电位来抑制AIF的释放。免疫荧光实验证实PAK5与AIF能够共定位在线粒体上,并且PAK5能够使线粒体中AIF的表达增加。提取线粒体蛋白,通过Western-Blot实验证实PAK5能够提高线粒体中BCL2/Bax的比例,降低线粒体膜的通透性。JC-1染色和流式细胞术证实PAK5能够提高线粒体膜电位。3.PAK5介导的AIF磷酸化抑制其核移位并促进乳腺癌增殖。细胞凋亡、Western-Blot实验证实PAK5能够抑制caspase非依赖的细胞凋亡。GST-pull down实验证实PAK5直接结合AIF的263-480a.a结构域。核浆分离证实PAK5能够阻止AIF进入细胞核。免疫共沉淀实验证实PAK5能够减弱AIF与importinα3之间相互作用。磷酸化蛋白质谱及免疫共沉淀实验验证PAK5磷酸化AIF的T281位点。核浆分离以及免疫共沉淀实验证实PAK5通过磷酸化AIF的Thr-281位点减弱其与importinα3的结合来抑制AIF核移位。CCK-8、克隆形成以及裸鼠成瘤实验证实磷酸化的AIF能够促进乳腺癌细胞增殖。免疫组化实验证实相较于乳腺癌旁组织、乳腺良性病,在乳腺癌组织中AIF的表达较高,且AIF核移位现象较少。AIF的表达与乳腺癌分级呈正相关,而AIF核移位与乳腺癌分级呈负相关。免疫荧光实验证实相较于乳腺癌旁组织、乳腺良性病,乳腺癌组织中PAK5与AIF在细胞质中共定位更强。结论:1.PAK5和AIF在乳腺癌临床组织样本中的表达呈正相关,与肿瘤分级呈正相关。PAK5和AIF表达高的患者预后差。2.PAK5与AIF之间存在相互作用,且共定位在细胞质中。3.PAK5通过降低线粒体膜通透性和升高线粒体膜电位来抑制AIF从线粒体释放。4.PAK5能够抑制caspase非依赖细胞凋亡的发生。5.PAK5能够减弱AIF与importinα3的相互作用来阻止AIF进入细胞核。6.PAK5通过磷酸化AIF的Thr-281位点来抑制AIF核移位。7.PAK5介导的AIF磷酸化能够促进乳腺癌细胞增殖。8.在乳腺癌临床病例中,AIF核移位与乳腺癌分级呈负相关。9.相较于乳腺癌旁组织、乳腺良性病,乳腺癌组织中PAK5与AIF在细胞质中共定位更强。