前言:胃癌是严重影响我国居民健康的恶性疾病之一。2021年发表在“CA:A Cancer Journal for Clinicians”杂志的最新统计数据显示每年新发胃癌病例已超过100万,居所有癌种第五位;每年胃癌死亡病例约76万,列在所有癌种第四位。进展期胃癌病人预后差的主要原因是局部侵袭和淋巴结转移。淋巴结转移的发生也是胃癌远处转移的重要初始步骤。淋巴结转移是胃癌中最常见的转移方式之一,可以发生在早期胃癌中,进展期胃癌中更易见。胃癌病人存在淋巴结转移与其治疗方式选择及病人预后密切相关。现有研究证据表明,原发肿瘤及局部淋巴结中存在新生的淋巴管,能够在一定程度上促进肿瘤转移。肿瘤中淋巴管生成主要是指原发癌灶、癌旁或远处转移等部位在原有淋巴管基础上产生新的淋巴管的过程,包括淋巴管的增生和增大。研究表明,淋巴管生成在胃癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌等多种癌症中均与肿瘤转移或预后相关。CRIP1（富含半胱氨酸的肠蛋白1）是含LIM结构域的蛋白家族成员之一,在多种肿瘤中存在异常表达。目前已经发现CRIP1在宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌等多癌种中高表达。CRIP1可以激活Wnt/β-catenin通路促进c-myc、cyclin D-1和β?catenin蛋白的表达进而调控EMT促进肿瘤细胞的侵袭与转移;转运锌离子到细胞内促进GSK-3β磷酸化激活GSK-3β/m TOR信号通路诱导EMT;促进Fas蛋白的降解从而提高癌细胞对氟尿嘧啶的耐受能力。此外,也有研究显示CRIP1在乳腺癌与食管鳞状细胞癌中发挥抑癌作用,CRIP1可以降低MAPK与Akt的磷酸化、增加cdc2的磷酸化从而抑制肿瘤细胞的增殖。与此同时,很多研究报道了肿瘤组织中CRIP1的高表达与淋巴结转移密切相关。本研究中,我们应用高通量基因芯片检测10对胃癌及配对癌旁组织中的m RNA表达谱,寻找到胃癌淋巴结转移的相关标志物CRIP1。我们接下来应用一系列体内外的功能实验探索了CRIP1基因在胃癌中的功能及其可能的作用机制。研究方法:1、运用定量PCR及免疫组化分别检测胃癌组织及癌旁组织中CRIP1m RNA和蛋白的表达。2、western blot:应用凯基生物公司的全蛋白提取试剂盒提取胃癌细胞蛋白,应用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。进一步利用western blot检测各实验组之间蛋白的差异表达。3、增殖相关检测方法:应用CCK8、EDU增殖检测、集落形成等增殖相关检测方法体外探索增殖能力改变,并且利用裸鼠皮下成瘤实验在体内水平检测基因对于增殖的调控作用。4、侵袭转移相关实验:Transwell实验检测CRIP1等基因对于胃癌细胞迁移、侵袭能力的调控作用。5、利用尾静脉注射肿瘤细胞,构建肺转移模型,在体内水平检测基因对于胃癌细胞转移能力的调控作用;构建腘窝淋巴结转移模型检测各干预组之间对于淋巴结转移的影响。6、统计学分析:所有统计学分析都基于SPSS第19版软件及Graph Pad Prism第八版软件完成。应用秩和检验分析CRIP1在胃癌组织和癌旁非癌组织中的差异表达。采用卡方检验分析比较CRIP1表达与临床病理特征之间的关系。结果:1、利用高通量芯片技术在10对胃癌及癌旁组织中筛选差异表达的基因,我们发现CRIP1在胃癌组织中的表达显著高于癌旁非癌组织、且在淋巴结转移阳性胃癌组织中表达明显高于未发生淋巴结转移的胃癌组织（Fold change>2.0,p<0.05）。在本单位胃癌生物样本库,进一步运用定量PCR验证了CRIP1 m RNA在胃癌组织中的高表达（p=0.037）,并且CRIP1高表达与淋巴结转移阳性正相关（p=0.034）。与此同时,运用免疫组化实验在大规模的胃癌组织芯片标本中验证CRIP1蛋白的表达,发现CRIP1蛋白在胃癌组织中表达明显高于正常组织（p<0.0001）,并且CRIP1高表达与淋巴结转移（p<0.001）、T分期（p<0.001）以及TNM分期（p<0.001）显著相关。这些结果提示CRIP1可能是胃癌中的重要生物标志物,可以作为淋巴结转移的标志物。2、运用淋巴管形成实验以及皮下成瘤组织淋巴管密度检测CRIP1对于淋巴管新生的调控作用,证实CRIP1在体内体外可以促进淋巴管新生。构建腘窝淋巴结转移模型观察CRIP1对于体内淋巴结转移形成的影响,发现过表达CRIP1能够显著增大淋巴结的体积（p=0.0003）以及淋巴结转移率（80%VS 40%）;敲减CRIP1能够显著抑制淋巴结的体积（p=0.0037）以及淋巴结转移率（0%VS 40%）。进一步利用增殖、侵袭相关功能实验证实过表达CRIP1能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移,相反,敲减CRIP1则抑制上述表型。体内皮下成瘤实验结果发现过表达CRIP1能够促进皮下成瘤的生长（p=0.026）以及成瘤的最终质量（p=0.028）;敲减CRIP1则抑制皮下成瘤的生长（p=0.042）以及成瘤的最终质量（p=0.034）。尾静脉肺转移模型实验结果发现CRIP1能够促进肺转移的形成。3、ELISA实验结果显示过表达CRIP1能够增加胃癌细胞培养基上清中VEGFC水平（p=0.0085）,敲减CRIP1则抑制VEGFC的分泌（p=0.0028）。进一步运用定量PCR和western blot实验证实CRIP1能在RNA和蛋白层面提高细胞内VEGFC的表达水平。接下来运用免疫沉淀联合质谱分析寻找CRIP1可能互作的蛋白,质谱数据显示CRIP1与CREB1具有相互作用,Co-IP实验结果证实CRIP1与CREB1可以相互作用。Western blot实验结果显示CRIP1可以提高CREB1蛋白133位丝氨酸磷酸化水平,改变CREB1的转录活性。我们进一步在CRIP1过表达细胞中敲减CREB1的表达,发现其能够逆转CRIP1促进CREB1磷酸化和VEGFC的水平。相反,在敲减CRIP1的细胞中过表达CREB1也能恢复CRIP1的作用。结论:1、CRIP1在10对胃癌及配对癌旁组织基因芯片结果中呈现高表达,且在淋巴结转移阳性胃癌组织中显著高于未发生淋巴结转移的胃癌组织。在本单位大规模胃癌组织标本验证中,相比于癌旁非癌组织,CRIP1 m RNA和CRIP1蛋白在胃癌组织中明显高表达。病理特征分析显示CRIP1高表达与胃癌淋巴结转移阳性呈现正相关,CRIP1高表达胃癌病人发生淋巴结转移比例越高。2、CRIP1在体外、体内促进胃癌细胞的增殖、侵袭,同时增加淋巴管新生、淋巴结转移。机制上,CRIP1通过与CREB1互作,提高其磷酸化水平及转录活性,在蛋白和RNA水平上调VEGFC水平。