本博士论文针对目前蛋白质组学研究中面临的分离富集及鉴定方面的热点与难点问题,将纳米金刚石材料与蛋白质分析结合起来,开展了一系列研究工作,发展了相关的新技术和新方法并进行了实际的应用研究：利用纳米金刚石成功实现了低丰度蛋白质/多肽的高效、快速、高回收率富集,并应用于宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常可能机制中差异蛋白质组学研究以及在肝癌血清肽组学中的实际应用；将纳米金刚石应用于MALDI靶上前处理中的研究,提高了多肽检出限,同时实现了靶上点样富集,提高了低丰度蛋白质的鉴定效率；利用该体系成功完成了蛋白酶的固定以及实际应用,提高了蛋白质的酶解效率；利用纳米金刚石表面多活性位点,成功实现了对其氨基苯硼酸的表面改性,从而完成了糖基化多肽的分离富集,在鼠肝蛋白液相单流份中鉴定了36个糖蛋白,确定了40条糖基化肽段；随后将纳米金刚石与磁性功能材料实现整合,使蛋白多肽的富集更快速、高效,提高了低分子量蛋白的鉴定与检出,并利用纳米金刚石磁性功能材料富集了经四环素刺激前后诱导乙肝病毒产生的HepAD38细胞分泌蛋白质组,研究了乙肝病毒改变免疫微环境在免疫耐受和病毒致病机制中的影响。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下：第一章绪论概述了蛋白质组学分离分析研究的主要技术手段和应用。对分离分析研究的新技术发展趋势,包括低丰度蛋白质或多肽分离富集、翻译后修饰蛋白质或多肽分离富集进展进行了简单的综述；详细概述了纳米金刚石的制备、性质等及其在分析化学、生物医药领域中的应用；提出了本论文选题的目的和意义。第二章针对低丰度蛋白及多肽的分离富集鉴定,利用爆炸法制备纳米金刚石表面多官能团的性能对低浓度多肽溶液进行了富集分析。表征了富集前后纳米金刚石的表面官能团改变,证明了对多肽或蛋白的充分富集能力。通过富集时间、富集容量、耐盐量、耐表面活性剂评价了纳米金刚石对多肽或蛋白的富集效率。通过不同pH值缓冲液进行了多肽富集实验,证明了该材料对多肽富集无pH值偏向性。通过实际样本胶内酶解多肽抽提液的直接冻干、zip-tip富集、纳米金刚石富集比较实验,纳米金刚石在低丰度蛋白质鉴定方面具有更好的表现。随后采用纳米金刚石辅助质谱鉴定应用于血清游离肽分离分析以及探索宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常的可能机制。我们在肝癌血清中寻找到了蛋白血纤维蛋白肽A(fibrinopeptide A)异常高表达,为后续的肝癌血清肽组学提供了参考数据。在IUGR新生鼠和正常新生鼠的肾脏蛋白质差异表达蛋白中寻找了可探索研究的波形蛋白以及串珠素蛋白。同时,证实能量代谢异常、氧化还原和凋亡的失衡以及信号转导和细胞增殖的异常可能参与了IUGR大鼠肾单位数目的减少和肾脏发育的异常。第三章针对提高质谱灵敏度与鉴定成功率问题,利用纳米金刚石对多肽或蛋白质的富集能力以及超细小颗粒特性,将其置于基质辅助激光解析质谱(MALDI)靶板作为MALDI靶上前处理基质提高了肽段的离子化效率。通过纳米金刚石作为辅助基质,使得肽段与基质更好的结合形成均匀分布样本层,无需MALDI激光寻找“hotspot"分析肽段,同一样本点从内到外激光定点分析肽段的重现性为11.8%,相对不锈钢靶板18.8%有较好的表现力。同时肽段的响应信号比直接点样分析提高约5倍,可以检测到0.1fmol肌红蛋白酶切肽段,以及62.5amol的标准肽。纳米金刚石除可进行辅助肽段离子化外,也可以实现靶上富集分析肽段,灵敏度较直接分析提高1个数量级,而且可以耐受500mN aCl,因此纳米金刚石在实际样品分析中比其他肽段前处理方法方便、灵敏。dNDs可以直接用于MALDI无机基质对小分子化合物的分析,同时亦可通过辅助涂层提高分析物的结晶均匀性、分析物的离子化效率从而进一步提高低丰度蛋白鉴定的成功率、可信度。因此dNDs辅助涂层在低丰度蛋白的鉴定过程中有着广阔的应用前景。第四章利用纳米金刚石的材料特性采用化学修饰进行了生物酶的固定,通过傅立叶变换红外光谱仪以及透射电镜等手段进行表征。生物酶在纳米金刚石固定化后,其耐热性、耐有机溶剂、耐酸性以及稳定性都有很好的提高,反复使用10次仍能保持60%的活性。通过与商品固定化酶的比较,其对蛋白质的酶解效率与质谱鉴定成功率都有明显提高。同时采用该方法进行了N-糖苷酶F的固定,10mmin完成了糖链的酶切,大大缩减了传统溶液酶解的时间,从而进一步提高了糖苷内切酶的酶解效率。第五章针对翻译后修饰蛋白中糖蛋白/糖肽的分离富集问题。利用纳米金刚石表面的多活性位点以及较大的比表面积,实现了对其功能化修饰以及糖肽的特异性富集。在超声分散条件下采用氨基苯硼酸对纳米金刚石进行功能化修饰,采用傅立叶变换红外光谱仪进行表征；通过复杂肽段中糖肽的特异性富集评价了该功能化材料的优点。与商品化硼酸磁珠相比,其选择性、富集效率与灵敏度都有较大的提高。采用160/18O定量标记法评价了纳米金刚石一一硼酸法对糖肽的富集回收率达72.2%。同时,我们将该方法用于大鼠肝脏样品液相分离部分中糖肽的富集,鉴定并确定了40条糖肽和36个糖基化位点,其中有7个位点在Swiss-prot和TrEMBL数据库有记录,新发现26个糖基化位点。通过上述研究表明氨基苯硼酸纳米金刚石可以快速、有效的富集糖肽,由于具有较高的富集回收率,富集灵敏度达250amol/μL,并且可以直接与MALDI-MS、LC-MS联用,可以将该方法用于实际样品中糖肽的分析鉴定。第六章针对分泌蛋白质的分离富集技术,采用水热法制备了具有超顺磁性的四氧化三铁磁性微球；采用溶胶-凝胶法在其表面包覆二氧化硅层,合成制备了具有核壳结构的Fe3O4@SiO2磁性硅球；并在其表面进行氨基硅烷化修饰,随后利用聚丙烯胺、碳化二胺、琥珀酰胺辅助反应试剂实现纳米金刚石在上述磁性功能材料上固定和键合。利用傅立叶变换红外光谱仪、透射电子显微镜等对我们制备的Fe3O4@SiO2@ [dND]n进行了表征。证实我们合成了以磁性材料为核的层层组装键合纳米金刚石。通过对标准蛋白酶解肽段/蛋白质的富集评价,证明该材料具有与纳米金刚石相似的富集能力,同时由于磁性材料的引入,大大提高了样品富集处理效率。采用Fe3O4@SiO2@[dND]n(?)寸蛋白的分离富集能力,我们成功富集了由四环素刺激前后诱导乙肝病毒产生的HepAD38细胞分泌上清,并采用iTRAQ技术进行了刺激前后分泌蛋白质表达量的差异分析。该材料的硅层表面与报道过的同类材料的聚合物表面相比,具有更好的生物相容性。将其应用于富集低丰度肽段,富集倍数达到100倍以上；即使对高浓度的盐溶液中的肽段仍能实现有效富集。总之,本论文围绕蛋白质组学研究的新技术、新方法,以纳米金刚石为基础建立了有效的分离富集等新方法,为解决蛋白质组学分析中的低丰度蛋白质、糖基化蛋白的分离富集及提高鉴定效率等问题提供了新颖有效的研究手段和方法。