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帕金森病(Parkinson’s disease，PD)作为常见的神经系统退行性疾病之一，其发病率仅次于阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)，且随着年龄的增加PD的发病率逐年增高，现有研究表明其发病与遗传、环境和年龄等因素互相作用有关。PD的主要病理变化为中脑黑质致密区(substantia nigra pars compacta， SNpc)多巴胺能神经元的死亡和残存神经元内路易小体(Lewy body)形成，同时众多证据表明小胶质细胞的活化、炎性介质的释放和α-突触核蛋白(α-synuclein)异常聚集会加重神经元的损伤。PD的临床症状主要以运动障碍为主，包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓与姿势步态障碍等。然而在PD的发病过程中，运动系统症状一般较晚出现，其早期以焦虑抑郁情感障碍、便秘、疼痛等非运动症状为主，因此在临床上发现运动障碍症状时再行脑部影像学检测诊断的PD患者多已发展至中晚期。临床上如何采取有效的检测手段在发病早期诊断PD，进而开展及时有效的药物治疗成为亟待解决的关键科学问题。近年来PD非运动症状相关检查，如影像学、血液及脑脊液的检查在对PD的早期诊断研究中发挥了重要作用，但PD患者早期黑质致密区的病理生理学机制至今尚未阐明。随着人们对PD脑内多巴胺能神经元死亡过程中蛋白质功能和生物学机制研究的逐步深入，发现PD早期黑质致密区多巴胺能神经元多种蛋白出现翻译后修饰水平异常，尤其以蛋白磷酸化修饰为主。因此本项目运用野生型与PD转基因型小鼠为研究对象，采用定量磷酸化蛋白组学技术对野生型与PD转基因型小鼠发病早期的黑质区组织蛋白进行组学鉴定，以筛选PD发病早期差异磷酸化蛋白及其相关上游激酶网络，旨在为阐明PD早期黑质多巴胺能神经元死亡的病理生理学机制提供新的研究思路和药物靶点。
目的：α-synuclein蛋白(一种突触前蛋白)编码A30P和A53T位点的基因突变是最常见的PD遗传病因，突变产生的α-synuclein蛋白异常聚集在多巴胺能神经元死亡过程中起到了核心作用。与此同时，神经元内异常聚集的α-synuclein蛋白引起的蛋白异常磷酸化可能在PD发病过程中发挥了关键性的作用，然而其诱导蛋白异常磷酸化参与多巴胺能神经元死亡的分子机制目前仍不清楚。本文通过定量磷酸化蛋白质组学技术对PD发病早期6月龄α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠(A30P和A53T位点双突变体；hm2α-SYN-39株)SNpc组织样品进行分析，期望深入了解PD早期病变的分子机制。
材料及方法：
(一)将20只6月龄α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠随机分为两组，分别为PD1组和PD2组，每组10只，同时将20只野生型小鼠分为CON1组和CON2组，每组10只，采用转棒行为学实验检测四组小鼠的运动能力。
(二)分离提取每组小鼠SNpc组织蛋白，经胰蛋白酶消化后，将样品经过高效液相色谱分离，亲和力浓缩和液相色谱-质谱串联分析(LC-MS/MS)。
(三)对差异磷酸化蛋白进行生物信息学分析。
(四)应用MPP+(1-Methyl-4-phenylpyridinium，1-甲基-4-苯基-吡啶离子)刺激大鼠原代皮层神经元建立PD细胞模型，在0h、0.5h和1h收集神经元蛋白，使用蛋白免疫印迹法(western bloting，WB)检测p25蛋白的表达水平。
(五)采用MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)腹腔注射野生型小鼠建立PD动物模型，通过WB检测p25和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达水平。
(六)体外激酶反应验证定量磷酸化蛋白质组学结果。
结果：
(一)定量磷酸化蛋白质组学技术共鉴定2136个磷酸化蛋白中的5351个磷酸化位点。按照变化1.5倍为阈值进行筛选，共计筛选到245个蛋白中的357个磷酸化位点上调，46个蛋白中的50个磷酸化位点下调。
(二)通过生物信息学分析，包括基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集以及基序分析，阐明α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠发病早期的分子机制。
(三)基于Scansite对差异磷酸化位点的上游激酶进行计算分析和预测，发现细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)是富集最广泛的蛋白激酶。
(四)结果表明在MPP+诱导的PD细胞模型和MPTP诱导的PD动物模型中p25/Cdk5通路被激活。此外，体外激酶反应验证Cdk5可直接磷酸化Ank2蛋白的第1889位丝氨酸位点(Ser1889)。
结论：
1.运用定量磷酸化蛋白质组学技术对α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠发病早期进行组学分析，鉴定异常磷酸化位点与蛋白并进行了生物信息学分析，探讨了PD早期磷酸化修饰异常参与SNpc多巴胺能神经元死亡的病理生理学机制。
2.神经系统关键蛋白激酶Cdk5与其伴侣分子p25形成的p25/Cdk5通路在PD早期被激活，p25/Cdk5及其下游磷酸化底物蛋白可能共同参与PD早期病变。
目的：α-synuclein蛋白(一种突触前蛋白)编码A30P和A53T位点的基因突变是最常见的PD遗传病因，突变产生的α-synuclein蛋白异常聚集在多巴胺能神经元死亡过程中起到了核心作用。与此同时，神经元内异常聚集的α-synuclein蛋白引起的蛋白异常磷酸化可能在PD发病过程中发挥了关键性的作用，然而其诱导蛋白异常磷酸化参与多巴胺能神经元死亡的分子机制目前仍不清楚。本文通过定量磷酸化蛋白质组学技术对PD发病早期6月龄α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠(A30P和A53T位点双突变体；hm2α-SYN-39株)SNpc组织样品进行分析，期望深入了解PD早期病变的分子机制。
材料及方法：
(一)将20只6月龄α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠随机分为两组，分别为PD1组和PD2组，每组10只，同时将20只野生型小鼠分为CON1组和CON2组，每组10只，采用转棒行为学实验检测四组小鼠的运动能力。
(二)分离提取每组小鼠SNpc组织蛋白，经胰蛋白酶消化后，将样品经过高效液相色谱分离，亲和力浓缩和液相色谱-质谱串联分析(LC-MS/MS)。
(三)对差异磷酸化蛋白进行生物信息学分析。
(四)应用MPP+(1-Methyl-4-phenylpyridinium，1-甲基-4-苯基-吡啶离子)刺激大鼠原代皮层神经元建立PD细胞模型，在0h、0.5h和1h收集神经元蛋白，使用蛋白免疫印迹法(western bloting，WB)检测p25蛋白的表达水平。
(五)采用MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)腹腔注射野生型小鼠建立PD动物模型，通过WB检测p25和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达水平。
(六)体外激酶反应验证定量磷酸化蛋白质组学结果。
结果：
(一)定量磷酸化蛋白质组学技术共鉴定2136个磷酸化蛋白中的5351个磷酸化位点。按照变化1.5倍为阈值进行筛选，共计筛选到245个蛋白中的357个磷酸化位点上调，46个蛋白中的50个磷酸化位点下调。
(二)通过生物信息学分析，包括基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集以及基序分析，阐明α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠发病早期的分子机制。
(三)基于Scansite对差异磷酸化位点的上游激酶进行计算分析和预测，发现细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)是富集最广泛的蛋白激酶。
(四)结果表明在MPP+诱导的PD细胞模型和MPTP诱导的PD动物模型中p25/Cdk5通路被激活。此外，体外激酶反应验证Cdk5可直接磷酸化Ank2蛋白的第1889位丝氨酸位点(Ser1889)。
结论：
1.运用定量磷酸化蛋白质组学技术对α-synuclein-A30P/A53T转基因小鼠发病早期进行组学分析，鉴定异常磷酸化位点与蛋白并进行了生物信息学分析，探讨了PD早期磷酸化修饰异常参与SNpc多巴胺能神经元死亡的病理生理学机制。
2.神经系统关键蛋白激酶Cdk5与其伴侣分子p25形成的p25/Cdk5通路在PD早期被激活，p25/Cdk5及其下游磷酸化底物蛋白可能共同参与PD早期病变。