花生是我国重要的油料和经济作物,产量世界第一,种植面积世界第二。由于我国的另外一个油料作物大豆产业受到国外冲击很大,所以花生的高产和稳产对于我国食用油产业的稳定及其在世界上的竞争力具有重要的意义。由于我国可耕地有限,农民常在同一块地上多年连续种植花生,因此,在我国许多花生老产区,花生连作障碍已成为制约花生产量的重要问题。长期的花生连作造成出苗率降低、结果数减少、产量下降,并且这种制约作用随着连作年限的延长而加重。造成花生连作障碍的主要因素包括土壤化感物质积累、酶活力下降和土壤微生物区系恶化。针对这个问题,国内外学者进行了大量研究。目前缓解花生连作障碍的方法主要包括轮作、土壤消毒、施加有机肥和施加有益微生物等。但是,由于受到地域、传统和技术的限制,目前这些方法仍不能被广泛用于克服花生连作障碍。前期我们课题组从重阳木的茎内皮分离得到一株内生真菌,命名为枫香拟茎点霉（Phomopsis liquidambari）。盆栽实验发现上壤接种P.liquidambari能够增加土壤酶活性、改善土壤微生物区系,有助于缓解花生连作障碍。进一步的分析发现内生真菌P.liquidambari接种后花生产量的提高均伴随着结瘤大量增加,籽粒蛋白也有所提高。花生生长所需氮素,大约40-50%从根瘤获得。因此,促进花生结瘤固氮对提高花生产量有重要作用。由于根瘤增加,花生生长强壮,一定程度上抵御了病害的发生。因此,我们认为促进结瘤和固氮是施加内生真菌P.liquidambari缓解花生连作障碍的主要原因之一。然而,P.liquidambari促进花生-根瘤菌建立共生、结瘤和固氮的机理仍不清楚。高浓度的酚酸是长期花生连作土壤的主要特征之一。先前研究表明高浓度的酚酸会导致连作土壤微生物区系失衡,同时也可能会对土壤根瘤菌的生长有强烈的抑制作用。对于花生而言,根际土壤低浓度的酚酸类物质有益于花生-慢生根瘤菌相互作用、识别、和建立共生结瘤。但是,如果根瘤菌的生长受到土壤高浓度酚酸的抑制,势必也会造成土壤中根瘤菌的数量和多样性降低,进而导致花生-根瘤菌建立共生结瘤能力下降,最终加重花生连作障碍。因此,维持连作土壤酚酸类物质的低浓度状态,是确保慢生根瘤菌健康生长、维持其生物学活性的前提条件,同时也为增加花生产量,缓解连作障碍提供重要的保障。因此,就目前而言,需要筛选一种经济的、高效的、和绿色的技术手段用于减少连作土壤中酚酸类化感物质的积累,从而有助于缓解花生连作障碍。本文研究发现,酚酸类化感物质如4-羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸、肉桂酸、芥子酸和阿魏酸在较低浓度下均能显著刺激花生慢生根瘤菌的生长、生物膜形成和nodC基因的表达,而高浓度的酚酸则显著抑制慢生根瘤菌的生理活动,同时进一步实验表明高浓度的酚酸类化感物质显著降低了花生的结瘤效率。接着我们探讨了是否内生真菌P.liquidambari能够对土壤中多种不同的酚酸类化感物质具有广谱高效的降解潜力。以酚酸类化感物质作为唯一碳源的实验表明,在液体培养条件下,内生真菌P.liquidambari能够高效地降解肉桂酸、芥子酸和阿魏酸,并且添加葡萄糖不会显著影响P.liquidambari的降解效率。进一步使用HPLC-MS和GC-MS检测了P.liquidambari对酚酸代谢的中间产物,同时给出了内生真菌P.liquidambari对肉桂酸、芥子酸和阿魏酸的详细降解途径。进一步研究发P.liquidambari在降解酚酸类化感物质时,涉及多种降解酶的作用,主要包括酚酸脱羧酶、漆酶和加氧酶。qRT-PCR结果也表明这些降解酶基因的转录水平与其活性、及相应代谢物的动态变化一致,同时发现P.liquidambari漆酶在酚酸类化感物质的降解中扮演着重要作用。此外,进一步实验发现即使在复杂的土壤条件中,内生真菌P.liquidambari也能高效地降解肉桂酸、芥子酸和阿魏酸。因此,这些结果表明内生真菌P.liquidambari离开其宿主环境后在外界环境中具有很强的适应能力,并且对酚酸类化感物质具有广谱高效的降解潜力,有利于消除酚酸对土壤慢生根瘤菌的抑制作用,有助于缓解花生连作障碍。先前研究表明豆科植物-根瘤菌的共生发育与宿主内多种内源信号分子的活性密切相关,其对于控制和调控共生过程至关重要。在这些信号分子中,H2O2和NO已被认为是响应生物和非生物胁迫过程的信号分子,并且越来越多的证据也表明H2O2和NO在豆科植物-根瘤菌建立共生结瘤中扮演着重要的作用。然而,H2O2和NO是否参与内生真菌P.liquidambari诱导的花生结瘤和固氮增加仍不清楚。本文研究表明与单独的慢生根瘤菌接种相比,共接种内生真菌P.liquidambari显著提高了花生根系内源H2O2和NO水平。使用特异性的H2O2（CAT,过氧化氢酶）和NO（cPTIO,2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧基-3-氧化物钾盐）清除剂显著阻碍了内生真菌P.liquidambari诱导的花生结瘤和固氮。CAT不仅抑制了P.liquidambari诱导的结瘤和固氮,同时也抑制了根系H2O2和NO的产生。然而,cPTIO不能抑制H2O2的生物合成,暗示着H2O2作为NO产生的上游信号分子。外源的H2O2和硝普钠（NO供体）恢复了特异性清除剂对P.liquidambari诱导的结瘤和固氮抑制,这进一步证明了上述实验结果。P.liquidambari、H2O2和SNP处理也显著地增加了共生相关基因SymRK和CCaMK的转录活性。此外,盆栽实验进一步确定了由P.liquidambari共生而引起的H2O2和NO信号途径增强与花生结瘤和固氮增加显著相关。本文首次报道了内生真菌P.liquidambari可以作为内生的诱导子通过增强依赖于H2O2/NO的信号交叉来增加花生-慢生根瘤菌相互作用,表明P.liquidambari可以通过改善花生生理状态进而增加花生结瘤固氮,有助于缓解花生连作障碍。土壤微生物是土壤健康和肥力的重要指标,不断恶化的土壤微生物群落结构是导致花生连作障碍的主要因素之一。先前研究指出土壤养分状态如NH4+和NO3-浓度与豆科植物结瘤效率间存在一定的相关性,同时氨氧化微生物群落的活性在土壤氮素形式的转化中扮演着重要作用。而土壤固氮菌群落,主要包括根瘤菌群体,其在土壤中的数量和多样性与豆科植物-根瘤菌建立共生结瘤的频率直接相关。此外,土壤微生物代谢功能多样性则能进一步为豆科植物-根瘤菌建立共生结瘤提供良好的土壤环境条件。然而,就目前而言,很少有研究详细指出土壤生物化学性质、微生物代谢活性、氨氧化微生物群落以及固氮菌群落之间的相互关系,及其可能在促进花生结瘤固氮中的潜在作用。植物根系分泌物包含多种多样的养分和次级代谢产物,被认为是影响土壤可利用养分状态和微生物群落结构的重要因素。本文研究表明内生真菌P.liquidambari与花生共生后其根系分泌物显著增加了连作土壤微生物代谢活性和代谢功能多样性。qRT-PCR和DGGE（变性梯度凝胶电泳）结果表明添加P.liquidambari共生的花生根系分泌物显著抑制了土壤氨氧化群落的丰度和多样性,然而却显著增加了土壤固氮菌群落的丰度和多样性。进一步克隆测序分析表明内生真菌P.liquidambari共生的花生根系分泌物抑制了连作土壤中的氨氧化古菌Thaumarchaeota archaeon,然而却显著刺激了固氮菌群如Enterobacter sacchari、Azospirillum halopraeferens、Bradyrhizobium lablabi、Rhodopseudomonas palustris、Bradyrhizobium icense、Azohydromonas australica 和 Bradyrhizobium oligotrophicum 的产生。进一步分析发现在响应的固氮菌群落中有多种固氮菌属于慢生根瘤菌群体,其增多与促进花生-根瘤菌结瘤增加直接相关。此外,土壤养分状态如NH4+和NO3-浓度也能从侧面反映上述功能微生物群落的动态变化。同时盆栽实验结果表明内生真菌P.liquidambari共生能显著促进花生-根瘤菌建立共生结瘤。根系分泌物组分检测表明增加的可溶性糖、氨基酸、总碳和总氮可能是提高土壤微生物活性的主要因素,而根系分泌物中有机酸、酚类和黄酮类物质浓度的增加可能是P.liquidambari接种抑制氨氧化微生物群体、以及诱导固氮菌群落增多的重要原因。因此,我们推测内生真菌P.liquidambari与花生共生后能通过改变根系分泌物的组分进而改善连作土壤微生物群落结构,尤其是增加连作土壤固氮菌群落的多样性,从而促进花生-根瘤菌建立共生结瘤,最终有助于缓解花生连作障碍。许多研究指出导致花生连作障碍的因素多种多样,主要包括土壤养分失衡、酶活性降低、有毒化感物质积累、微生物区系恶化和土传病原菌增加。先前盆栽实验指出接种内生真菌P.liquidambari能有效地增加土壤酶活、改善微生物区系,最终有助于提高花生产量。同时也发现接种P.liquidambari能够显著减少由凋落物残体腐解引起的化感物质积累。因此,前期研究结果表明内生真菌P.liquidambari具有缓解花生连作障碍的潜力。但是到目前为止,仍没有田间证据用于全面地评估内生真菌P.liquidambari作为一种有效的微生物接种菌剂来缓解花生连作引起的相关问题。本文中,我们设计了田间小区实验用于评价内生真菌P.liquidambari在田间条件下缓解花生连作障碍的效果。结果表明即使在复杂的田间条件下,内生真菌P.liquidambari也能够有效地定殖于根际土壤和花生根系,并且与对照组相比,接种P.liquidambari显著改善了土壤微生物和化学特性,增加花生植株的N、P和K同化,同时显著抑制了花生疾病的发病率。数据分析表明花生产量增加与接种P.liquidambari导致的根际土壤微生态环境和植株生理状态改善显著相关。此外,进一步的研究发现,内生真菌P.liquidambari接种也显著改善了连作花生品质。因此,本文结果首次在田间条件下提供证据表明接种内生真菌P.liquidambari具有缓解花生连作障碍的实际应用潜力。总之,本研究从内生真菌P.liquidambari降解土壤酚酸类化感物质、改变花生生理状态、增加土壤根瘤菌数量和多样性等角度,阐述内生真菌P.liquidambari促进花生与根瘤菌建立共生结瘤的潜在作用机理,同时也全面评估了内生真菌P.liquidambari在田间条件用于缓解花生连作障碍的可能性,试图为花生连作障碍的缓解找出更加有效的方法,为花生稳产高产提供科技支持。