酿酒酵母蛋白酶A(PrA)〔EC3.4.23.25〕为酿酒酵母产生的一种酸性蛋白水解酶。纯生啤酒采用低温膜过滤除菌达到生物稳定性,因而蛋白酶A的活性不被破坏。由于啤酒的pH值在4.3-4.4的酸性范围内,因此啤酒被消费者消费之前,蛋白酶A都会降解啤酒中的蛋白和多肽,尤其是当啤酒中的泡沫阳性蛋白被蛋白酶A降解后会导致啤酒的泡沫衰减、泡持性降低。啤酒的泡沫性能是用来衡量啤酒质量的一个重要指标。前人的研究结果证实啤酒中的大麦脂转移蛋白1(LTP1)是对啤酒泡沫稳定性最为关键的蛋白,这种蛋白是底物特异性较小的酵母蛋白酶A的作用底物,这使得纯生啤酒的泡沫衰减问题更加突出。为从根本上解决纯生啤酒的泡沫衰减问题,本研究论文中从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中通过PCR分别扩增得到了酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子(ADH1 promoter), MFal信号肽序列(MFals)、细胞色素C终止子序列(CYC1 terminator)等表达调控DNA序列；从二棱大麦(Hordeum vulgare)基因组中扩增得到了大麦脂转移蛋白1(LTP1)的编码序列,并构建了酿酒酵母的大麦脂转移蛋白1的表达盒。将遗传霉素G418的抗性序列KanMX作为筛选标记与大麦Ltp1表达盒共同克隆到质粒YEplacl81的多克隆位点中,得到酿酒酵母大麦LTP1分泌表达型质粒YEp181-KAMLC。使用质粒YEpl81-KAMLC对酿酒酵母WZ65进行转化并使用酿酒酵母转化子菌株进行发酵实验,采用HPLC对大麦Ltp1表达盒的下游产物进行检测。检测结果表明,大麦脂转移蛋白1在酿酒酵母菌株WZ65中得到了分泌表达,在发酵开始的24小时内大麦脂转移蛋白1的产量增加较为缓慢,之后有较大的提高,72小时后大麦脂转移蛋白1分泌量的增加速度变慢。随着发酵时间的延长,大麦LTP1的产量-直呈现上升趋势。到发酵的132小时,发酵液中大麦脂转移蛋白1的分泌量达到29.45mg／L。使用含有大麦Ltp1表达盒和KanMX标记序列的转化DNA片段同源重组到酿酒酵母基因组上PEP4基因位点,使一个PEP4等位基因的编码序列被外源基因序列所替换。这样将会使酿酒酵母在表达啤酒泡沫阳性蛋白-大麦LTP1的同时,由于PEP4一个等位基因的缺失而造成其编码产物-蛋白酶A表达的降低,从而达到既增加泡沫阳性蛋白LTP1的含量,又有效降低其被蛋白酶A的降解作用。通过对转化子的筛选和鉴定,得到了基因型为PEP4/pep4::KanMX-Ltpl的酿酒酵母重组子菌株。对得到的重组菌株进行发酵培养,通过采用变性不连续SDS-PAGE釉Tricine-SDS-PAGE方法对经过处理的发酵液进行分析发现,本实验中所用到的对酿酒酵母重组菌分泌到培养液的大麦LTP1两种电泳分析方法中,Tricine-SDS-PAGE方法要比普通的SDS-PAGE方法优越。酵母表达的分子量大小约10KDa的蛋白条带能够得到很好的分离。进一步免疫印迹实验证实,重组菌株分泌的分子量对应于10KDa左右的表达产物为大麦LTP1。为了确保重组菌株在工业生产中的安全性,需要对抗性选择标记KanMX进行删除。TEF1启动子不能被本实验中所用的酿酒酵母表达系统所识别,因此使用TEF promoter更换了Sh ble表达盒中的TEF1 promoter,并构建了质粒pSH47/ZEO,利用Cre/loxP系统对重组子染色体上的KanMX进行了删除,并成功的使酵母细胞丢掉了质粒pSH47/ZEO.最终获得了大麦Ltp1表达盒结构完整、整合位点精确的酿酒酵母重组菌株。对不同发酵时期LTP1的浓度检测结果表明,在12°P未加酒花的麦汁中重组菌株S.c-Ltplα和S.c-Ltplβ在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到18.76和18.28mg/L；在8°P添加酒花的麦汁中重组菌株S.c-Ltplα釉S.c-Ltplβ在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到12.07和12.13mg/L。对获得的重组菌株S.c-Ltplα釉S.c-Ltplβ进行继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、絮凝性和蛋白酶A活性等生理生化指标进行了测试。重组菌株经过继代培养30代后遗传性能稳定。重组菌株与出发菌株相比,蛋白酶A活性降低了30%左右,对数生长期变慢,但稳定期的细胞浓度与对照菌基本相当,其他生理指标与对照菌株无明显差异。通过酿酒试验对多项指标的测试结果表明,重组菌株酿造的啤酒口味与现行其他干啤相近,各项理化指标均达到国家标准优级,泡持时间从原来的202s提高到326s。