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单精子胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）技术已在许多动物上获得成功,在猪上也已获得ICSI后代。随着转基因动物及胚胎生物技术研究的深入发展,猪ICSI研究越来越受到人们的重视。当前,猪ICSI胚胎生产的效率仍然较低,许多因素制约着猪ICSI成功率,相关机理了解较少。本研究借助于显微操作技术,将猪冻精注入体外成熟（IVM）卵母细胞内,通过对注射卵进行体外培养与观察,了解猪ICSI胚胎发育情况,比较不同激活、不同成熟培养方法及在胚胎培养液中添加L-cys、采用共培养技术等对ICSI胚胎体外发育的影响,并比较冻精ICSI胚胎和体外受精（in vitro fertilization, IVF）胚胎的体外发育能力；应用Real-time PCR技术检测DNA甲基化相关基因（DNMT1和DNMT3A）及抗凋亡基因Bcl-2的表达规律,实验内容和结果如下：1.猪ICSI胚胎注射后,分别使用电激活和电激活与化学激活联合激活的方法对ICSI胚进行激活,结果表明,猪ICSI胚电激活后,在NCSU-23中培养4 h,然后转入到添加2 mM的6-DMAP勺培养液中培养6 h,再移入NCSU-23中进行继续培养,胚胎卵裂率可达75.6%,明显高于单纯电激活组的卵裂率（68.3%）；但2种激活方法对其囊胚发育率的影响差异不显著（P>0.05）2.用3种不同的成熟培养液对猪ICSI激活后胚胎进行培养,用不含BSA的NCSU-23进行IVM,所获得卵母细胞进行ICSI操作后体外培养48 h后,卵裂率达783%,明显高于用TCM199+10%NCS组和0.1%PVA组（分别为67.6%和64.8%）,但3组间桑椹胚发育率和囊胚发育率差异不显著（P>0.05）,说明卵母细胞的成熟方法并不影响ICSI胚胎的发育。3.先在含1.71 mML-cys的NCSU-23培养液中培养3 h后,再转入不含L-cys的培养液中培养,卵裂率和囊胚率与对照组相比,差异均不显著,表明添加L-cys并未改善ICSI胚胎的发育状况。4.经激活处理的猪ICSI胚胎分别与颗粒细胞、卵丘细胞进行共培养,或直接放入NCSU-23培养液中培养,结果表明,采用颗粒细胞或卵丘细胞共培养猪ICSI胚胎,卵裂率较对照组有大大提高,其中与卵丘细胞共培养的ICSI胚胎卵裂率高达93.3%,但各组囊胚发育率没有明显变化（P>0.05）。5.用本实验室制备的猪冷冻精子进行ICSI和IVF研究,所获胚胎分别进行体外培养,比较不同来源的猪IVP胚胎体外发育能力。结果表明,用冻精生产的ICSI胚卵裂率和囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冻精进行IVF所获的76.9%卵裂率和19.2%囊胚率（P<0.05）。6.本实验以猪GV期、MⅡ期卵母细胞和猪IVF和ICSI 2-细胞,4-细胞、8-细胞、16-细胞和桑椹胚期胚胎为研究对象,采用Real-time PCR技术对与DNA甲基化相关基因（DNMT1, DNMT3A）的表达变化规律进行研究。结果发现,在卵母胞成熟过程中,DNMT1 mRNA持续高水平表达；在胚胎发育早期,IVF胚胎和ICSI胚胎的DNMT1 mRNA的表达量均急剧降低,可能与胚胎早期去甲基化有关；与IVF胚相比,ICSI胚胎DNMT1具有相同的表达趋势,只有在4-cell时高于IVF胚。DNMT3AmRNA在卵母细胞成熟过程中就开始急剧下降,经2-8cell阶段的低水平表达后又开始上升；与IVF胚相比,ICSI胚8-cell后DNMT3AmRNA表达量小于IVF胚。7.采用Real-time PCR技术对猪IVF、ICSI胚胎不同发育时期Bcl-2 mRNA的表达进行相对定量分析,结果表明随着胚胎的不断发育,IVF与ICSI胚胎的Bcl-2 mRNA表达量均逐渐下降,且ICSI胚胎的下降趋势较IVF胚胎明显,说明胚胎抑制凋亡的能力下降,这可能是造成胚胎凋亡的主要原因。