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背景和目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)在绝大多数患者中呈现持续感染状态,最终可引起慢性肝炎、肝硬化,甚至在一些患者中发展为肝癌。HCV在体内引起慢性感染并成功在体内持续存在,部分原因是通过某些途径逃避宿主免疫和干扰素诱导的抵御反应。流行病学研究发现接近20%的急性HCV感染患者在不进行治疗的情况下自发清除病毒,这提示固有免疫和/或适应性免疫应答在控制HCV感染中发挥重要作用。单核细胞和巨噬细胞是对抗病原体入侵的第一道防线,依赖其强大的吞噬功能和抗原提呈功能发挥重要的免疫监视和免疫调节作用。然而,它们在慢性丙型肝炎感染中的作用仍然不是十分清楚。我们在前期工作中发现丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core protein)抑制单核细胞分化为树突状细胞(Dendritic cells,DCs)。本实验中,我们主要研究HCV core蛋白是否影响外周血单核细胞分化为巨噬细胞。这可能是HCV持续感染的重要原因。研究方法:利用梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear,PBMCs),利用免疫磁珠分选方法纯化CD14+单核细胞。培养纯化后的CD14+单核细胞,加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)诱导5天,换液后加入干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)继续诱导24小时,使单核细胞向M1型巨噬细胞极化;加入巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)诱导5天,换液后加入白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和IL-13继续诱导24小时,使单核细胞向M2型巨噬细胞极化。利用流式细胞术、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)和实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain,RT-q PCR),分别在表型、细胞因子和基因水平验证巨噬细胞的诱导是否成功。从健康者和直接抗病毒药(direct-acting antivirals,DAAs)治疗前后的慢性丙型肝炎病毒(Chronic Hepatitis C virus,CHC)感染患者的外周血中分离出单个核细胞。利用免疫磁珠纯化CD14+单核细胞,利用上述相应的刺激剂和刺激条件诱导单核细胞极化为M1和M2两种亚型的巨噬细胞。在表型、细胞因子分泌和基因表达层面分析HCV对巨噬细胞极化的影响。在体外实验中,纯化健康者外周血CD14+单核细胞,在M1和M2型巨噬细胞诱导培养体系中加入HCV core蛋白或β-半乳糖苷酶,利用流式细胞术、ELISA和RT-q PCR,分别在表型、细胞因子和基因水平测定HCV core蛋白对巨噬细胞极化的影响。另外,行吞噬实验和T细胞增殖实验,利用流式细胞术检测加或不加HCV core蛋白诱导而成的巨噬细胞的吞噬功能、抗原提呈功能及对CD4+T细胞的免疫调节功能。利用western blot测定HCV core蛋白对巨噬细胞信号传导与转录激活子(Signal Transducer And Activator Of Transcription,STAT)表达的影响。为了研究HCV core蛋白抑制单核细胞向巨噬细胞分化的分子机制,toll样受体(toll-like receptor,TLR)2的配体(Pam3CSK4)、TLR2的抗体和STATs的抑制剂加入巨噬细胞诱导体系中进行研究。如上,利用流式细胞术、ELISA和RT-q PCR检测信号分子TLR2和STATs对巨噬细胞极化的影响。研究结果:(1)分离纯化健康人外周血CD14+单核细胞,加入GM-CSF、IFN-γ和LPS可成功诱导M1型巨噬细胞;加入M-CSF、IL-4和IL-13可成功诱导M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞高表达表型CD80、CD86,分泌较高水平的促炎性细胞因子TNF-α,高表达基因诱导型一氧化氮合酶(Inducible NitricOxide Synthase,i NOS);而M2型巨噬细胞高表达CD163、CD206,分泌较高抗炎性细胞因子IL-10,高表达基因精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)。(2)与健康对照者相比,慢性丙型肝炎患者来源的单核细胞,分化为M1和M2型巨噬细胞的能力均是受损的。而DAAs治疗对HCV病毒部分清除后,HCV患者巨噬细胞的极化能力得到部分恢复,进一步验证了HCV病毒抑制单核细胞向巨噬细胞极化。(3)体外实验证实,HCV core蛋白抑制单核细胞向M1和M2型巨噬细胞极化,并抑制极化的M1和M2型巨噬细胞的吞噬功能。而且HCV core蛋白参与诱导的M1型巨噬细胞抑制自体和同种异体的CD4+T细胞增殖,而该蛋白参与诱导的M2型巨噬细胞促进自体和同种异体的CD4+T细胞增殖。(4)Pam3CSK4和HCV core蛋白作用类似,在表型、细胞因子和基因水平抑制单核细胞分化为M1和M2型巨噬细胞。而TLR2的抗体可以逆转HCVcore蛋白的抑制作用。HCV core蛋白抑制M1型巨噬细胞STAT1的磷酸化和M2型巨噬细胞STAT3的磷酸化水平。STAT1的抑制剂(fludarabine)和STAT3的抑制剂(stattic)在基因水平而非表型和细胞因子水平分别抑制M1和M2型巨噬细胞的极化。结论:(1)利用GM-CSF、IFN-γ、LPS可成功诱导外周血单核细胞极化成为M1型巨噬细胞,而利用M-CSF、IL-4、IL-13可成功诱导单核细胞成为M2型巨噬细胞。(2)HCV抑制单核细胞向M1和M2型巨噬细胞极化。(3)HCV core蛋白抑制单核细胞向巨噬细胞分化。而且,HCV core蛋白使M1和M2型巨噬细胞吞噬功能下降;使M1和M2型巨噬细胞的抗原提呈功能及对T细胞的调节功能紊乱。(4)在慢性HCV感染中,HCV core蛋白通过TLR2/STATs信号抑制单核细胞极化为巨噬细胞。因巨噬细胞分化障碍而引起的免疫功能紊乱可能是HCV持续感染和难以清除的重要原因。本文的创新点是通过对HCV抑制巨噬细胞分化的作用及机制研究,提出阻断HCV core蛋白与TLR2的结合可能是治疗HCV感染的一种新方案。