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目的:采集含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞,克隆人IgG重链Fd段和轻链K链基因片段,构建人噬菌体抗体库,并筛选抗bFGF噬菌体抗体克隆,获得高效价的bFGF抗体基因。 方法:收集系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和皮肌炎(DM)等自身免疫病患者外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA后逆转录获得cDNA第一链,通过PCR扩增抗体重链Fd段和轻链κ链基因片段,回收680bp左右的目的片段,将κ链基因片段经Sac Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切后连接到噬菌粒载体pComb3中,将构建的重组噬菌粒载体pComb3-κ电转化大肠杆菌XL1-Blue菌构建成κ链文库。随后将重链Fd段经Spe Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后连接到κ链质粒文库中,将构建的重组噬菌粒载体pComb3-κ-Fd电转化XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。用bFGF包被酶标板,对抗体库进行3轮固相筛选,获得能结合bFGF的噬菌体抗体克隆,经phage-ELISA进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。 结果:RT-PCR扩增获得了人IgG重链Fd段和轻链κ链基因片段,将κ链插入到pComb3噬菌粒中构建的人IgGκ链基因库(pComb3-κ)库容约为1.2×108;将人IgG重链Fd段克隆入pComb3-κ中构建人Fab抗体基因库,库容约为2.5×107;辅助噬菌体超感染后建立了人Fab噬菌体抗体库,滴度为4×1011pfu/mL,经过3轮“吸附—洗脱—扩增”的淘选富集,携带有抗bFGF特异性抗体的噬菌体得到了有效的富集;挑选26个克隆进行挽救,经phage-ELISA检测,结果显示获得4个具有高bFGF特异性和较高亲和力的Fab噬菌体抗体克隆。 结论:利用含高效价bFGF自身抗体的自身免疫患者淋巴细胞构建人Fab噬菌体抗体库,能有效地从中筛选出与bFGF特异结合的高亲和力的噬菌体抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。