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目的:甲状腺激素在胎儿脑发育过程中占据着不可或缺的重要地位,如果在妊娠期间,母体发生甲状腺激素的缺乏,将会对胎儿神经系统的发育造成明显而不可逆转的损伤,可能导致后代学习和记忆能力的下降。多个权威流行病学调查发现,母亲在妊娠期间患亚临床甲状腺功能减退症（subclinical hypothyroidism,SCH）可能会导致其后代神经智力发育障碍,而适时适量的左旋甲状腺素（levothyroxine,L-T4）替代治疗可以有效改善这种不良影响。本课题组前期通过莫里斯水迷宫（Morris water-maze,MWM）和长时程增强实验（long-term potentiation,LTP）发现,怀孕期间SCH母鼠的后代仔鼠出现了空间学习和记忆能力的减退,但其中的机制尚不明确。神经生长因子（nerve growth factor,NGF）参与了神经系统发育过程中的多种生理活动,如神经元存活、增殖、分化、抗凋亡,促进轴突和树突的生长,增强突触可塑性等,对胎儿神经系统的发育举足轻重。NGF介导的原肌球蛋白受体激酶（tropomyosin receptor kinase,Trk）A信号通路发挥促进神经元增殖的作用,抑制p75神经营养受体(p75 neurotrophy receptor,p75NTR)信号通路发挥抗神经元凋亡的作用。已有研究报道,围产期甲状腺功能减退症（overt hypothyroidism,OH）大鼠的后代大脑皮层和小脑中NGF表达降低,抑制TrkA信号通路的表达,促进p75NTR信号通路的表达,进而破坏TrkA/p75NTR信号通路的平衡。然而,尚不明确SCH母鼠后代仔鼠海马发育过程中是否存在TrkA/p75NTR信号通路的失衡。本研究旨在探讨仔鼠神经认知能力损害与妊娠期SCH大鼠后代海马中NGF相关的TrkA/p75NTR信号通路平衡之间的关系,研究怀孕期间L-T4替代治疗是否可以通过改善TrkA/p75NTR信号通路的平衡改善仔鼠海马发育,并确定最佳干预时间。方法:1、将成年Wistar雌性大鼠随机分为六组（每组n=15）:（1）对照（control group,CON）组:行甲状腺切除假手术,每日予以颈部皮下注射生理盐水50μl/（100g?d）;（2）OH组:行甲状腺切除术,每日予以颈部皮下注射生理盐水50μl/（100g?d）,建立OH模型;（3）SCH组:利用成功建立的OH模型,每日予以颈部皮下注射L-T4溶液1.00μg/（100g?d）,建立SCH模型;（4）E10治疗组:利用成功建立的SCH模型,从妊娠第10天（day 10 of pregnancy,E10）开始,将L-T4溶液剂量调整为1.25μg/（100g?d）,建立亚临床甲减L-T4 E10治疗模型;（5）E13治疗组:利用成功建立的SCH模型,从妊娠第13天（day 13 of pregnancy,E13）开始,将L-T4溶液剂量调整为1.25μg/（100g?d）,建立亚临床甲减L-T4 E13治疗模型;（6）E17治疗组:利用成功建立的SCH模型,从妊娠第17天（day 17 of pregnancy,E17）开始,将L-T4溶液剂量调整为1.25μg/（100g?d）,建立亚临床甲减L-T4 E17治疗模型。2、检测各组母鼠妊娠前后血清促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH）、总甲状腺素（total thyroxine,TT4）水平,验证造模成功后进行下一步实验。3、Western检测各组仔鼠出生后第7天（postnatal day 7,PND7）和第40天（postnatal day 40,PND40）海马中NGF、神经生长因子前体（pro-nerve growth factor,proNGF）以及NGF/TrkA、NGF/p75NTR信号通路相关蛋白的表达。4、免疫荧光染色定位并检测神经元核抗原（Neuronal nuclear antigen,NeuN）、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（phospho-cAMP response element-binding protein,p-CREB）和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved caspase-3）在PND7和PND40仔鼠海马CA1区的表达。5、使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling,TUNEL）和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色的双重染色技术检测PND7和PND40仔鼠海马CA1区神经元的凋亡情况。结果:1、SCH组、OH组及三个SCH治疗组母鼠造模情况孕前和孕后两次母鼠的甲功结果显示,与CON组相比,SCH组和OH组母鼠TSH水平显著升高（p<0.05）,OH组母鼠TT4水平显著降低（p<0.05）,SCH组母鼠TT4水平与CON组没有显著差异（p>0.05）。在进行L-T4治疗之前,三个治疗组（E10治疗组、E13治疗组和E17治疗组）的母鼠甲功水平与SCH组相似（p>0.05）。治疗后三个治疗组与的母鼠甲功与CON组相比无显著差异（p>0.05）。验证各组造模成功,可以进行下一步实验。2、PND7仔鼠NGF、proNGF以及NGF/TrkA、NGF/p75NTR信号通路相关蛋白的表达情况（1）Western实验结果显示,在PND7仔鼠海马中,与CON组相比,OH组和SCH组proNGF的表达明显增加,OH组、SCH组和E17组NGF的表达明显降低,OH组、SCH组、E17组和E13组NGF/proNGF的比率明显降低（p<0.05）。（2）Western实验结果显示,在PND7仔鼠海马中,与CON组相比,OH组和SCH组NGF/TrkA信号通路相关蛋白（p-TrkA、p-ERK1/2和p-CREB）表达明显降低（p<0.05）;E10组和E13组p-TrkA和p-CREB的表达与CON组相比无显著差异（p>0.05）;E10组p-ERK1/2与CON组相比无显著差异（p>0.05）;六组各总蛋白水平无统计学差异（p>0.05）。免疫荧光染色定位并检测海马CA1区p-CREB的表达,结果与Western实验结果一致。（3）Western实验结果显示,在PND7仔鼠海马中,与CON组相比,OH组和SCH组NGF/p75NTR信号通路相关蛋白(p75NTR、p-JNK、p53、Bax和cleaved caspase-3)表达明显升高（p<0.05）;E10组和E13组Bax和cleaved caspase-3的表达与CON组相比无显著差异（p>0.05）;E10组p75NTR的表达与CON组相比无显著差异（p>0.05）;p53和p-JNK在E10组、E13组和E17组的表达水平与CON组相比明显升高（p<0.05）;六组总JNK的表达水平无统计学差异（p>0.05）。免疫荧光染色定位并检测海马CA1区cleaved caspase-3的表达,结果与Western实验结果一致。TUNEL实验结果表明,与CON组相比,OH组、SCH组和E17组海马神经元凋亡情况明显增加,E13组和E10组未观察到显著变化。3、PND40仔鼠NGF、proNGF以及NGF/TrkA、NGF/p75NTR信号通路相关蛋白的表达情况Western实验、免疫荧光染色和TUNEL实验结果均显示,在PND40仔鼠海马中,与CON组相比,OH组、SCH组和三个治疗组NGF、proNGF以及NGF/TrkA、NGF/p75NTR信号通路相关蛋白的表达水平无统计学差异（p>0.05）,海马神经元凋亡情况未观察到显著变化。结论:1、与CON组仔鼠相比,母体孕期SCH抑制仔鼠海马中NGF/TrkA信号通路的表达,激活NGF/p75NTR信号通路的表达,提示可能打破了TrkA/p75NTR信号通路的平衡,导致其后代在产后7天时海马神经元增殖减少而凋亡增加,从而影响其后代的神经认知能力。2、在怀孕初期给予L-T4替代治疗可一定程度地改善母鼠孕期SCH对后代神经发育造成的不良影响,最佳治疗时间应在E10之前。3、母体妊娠期SCH导致后代仔鼠海马中NGF相关蛋白的表达异常可能是一过性的,仔鼠在产后40天时各蛋白的表达有所恢复。