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人乳腺珠蛋白(human mammaglobin,hMAM)属于子宫珠蛋白(uteroglobin,UG)超家族,是93个氨基酸构成的多肽,分子量为10.5kDa。hMAM的生理功能不明,但UG超家族的成员全都是分泌性、少有糖基化的小分子二聚体蛋白,主要在粘膜组织中表达,结构相似,功能相近,包括调节炎症,结合类固醇配体等,具有免疫抑制作用。大多数研究都证实hMAM基因只在成人乳腺中表达,在很多乳腺肿瘤中过度表达,因而可作为乳腺及乳腺癌特异性标志物。hMAM的潜在应用包括:乳腺癌淋巴结、外周血和骨髓转移的监测;组织来源未知肿瘤的鉴别;乳腺癌检测尤其是早期检测,不同部位的hMAM和hMAM mRNA检测可能成为原发性,转移性和隐匿性乳腺癌的标志物。同时hMAM的组织特异性也为它作为治疗靶点提供了可能。研究取得的主要结果如下: 1.通过从人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株MDA-MB453提取总RNA,RT-PCR成功获得编码人hMAM的cDNA。乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型:hMAM和hMAM(Isoform),长度分别为279和270bp,二者相差9个连续碱基,其翻译产物相差3个连续氨基酸残基(-79～-81,VFM),二者基因和氨基酸序列匹配度均为96%。cDNA片段分别插入原核表达质粒pGEX-KG,构建的质粒命名为pGEX-KG/hMAM和pGEX-KG/hMAM(ISO)。 2.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,获得了高水平表达的融合蛋白GST-hMAM和GST-hMAM(ISO),并确定融合蛋白在BL21中高效表达的最佳诱导条件为:1mmol/L IPTG在37℃诱导表达3h。SDS-PAGE分析可见,融合蛋白约占细菌总蛋白的30%,表达形式为不溶性包涵体,其分子量约为36kDa。 3.大量诱导表达融合蛋白,包涵体洗涤后变性溶解,经反相作用层析初步纯化。初步纯化的GST融合蛋白经超滤置换缓冲溶液、复性、阴离子交换层析,表达蛋白得到了有效纯化。1g菌体(湿重)可获得约11mg纯度分别为96.5%和95.0%的融合蛋白,得率约为3.5%,纯化蛋白浓度为0.53mg/mL。 4.实验中hMAM(Isoform)与hMAM在包括表达形式、复性条件、色谱性状等方面未见明显差异。 研究表明,从人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株MDA-MB453克隆hMAM及其突变体基因,构建原核表达载体pGEX-KG/hMAM和pGEX-KG/hMAM(ISO)进行原核表达,