胰岛细胞移植是治疗糖尿病的最佳有效方法之一，然而胰岛细胞移植对供胰的需求量大（需要2-4个成人胰腺），胰岛来源不足是目前限制其临床应用的重要原因。因此探索新的胰岛细胞途径成为研究的热门研究之一。近年来，随着组织工程及细胞工程的日益起色，干细胞研究为扩大胰岛来源开辟了新的路线。　　机体在生理状态下，或者受到损伤时，体内许多细胞死亡，但有些器官能够更新这些细胞，从而可以使机体的正常机能得以维持，这种再生潜能便是依赖于成体干细胞(adult stem cell，ASC)。胰腺在肥胖或妊娠的情况下也能够发生生理性增生，提示在胰腺内也存在可以增殖分化的成体干细胞[1]。与其它成体干细胞相比，胰腺干细胞的研究较为滞后。目前还没有建立获得广泛认同的胰腺干细胞系[2]。根据发生学起源，胰腺内的成体干细胞属于起源于中胚层的间充质干细胞，它的特点是具有多向分化潜能并且能够自我更新，可分化为胰腺组织的各种细胞。目前认为，间充质干细胞可能是可诱导分化为胰岛样细胞团的祖细胞（或称前体细胞），有望成为解决胰岛来源的途径[3]。　　目前，胰腺间充质干细胞存在的部位还没有完全确定。胰岛内部、胰腺外分泌腺内、胰腺导管内均可能存在分化程度不同的干细胞或祖细胞[4]。目前研究认为朗罕氏胰岛可由胰腺导管上皮细胞及位于胰岛内部的胰岛源性前体细胞(islet-derived precursor cells，IPCs)分化新生而成。多个实验室报道离体分离培养的胰腺导管上皮细胞，经条件培养后能获得成纤维样细胞，表达CD13、CD29、CD44、CD49b、CD54等抗原，与间充质干细胞相一致[5、6]。将这些培养后的胰岛样细胞移植入糖尿病小鼠体内，可释放胰岛素，降低血糖，延长受体存活时间。这些研究为建立工程性β细胞系以获得无限的胰岛细胞来源带来了新的曙光。　　以目前的技术，在分离纯化胰岛过程中，只有不到10％的胰岛组织得以应用，其余均被废弃。胰导管正是存在于被“废弃”的组织中。如果能够分离并诱导其增殖分化为有功能的胰岛样细胞团，将为扩大胰岛来源提供新的途径。　　胰腺导管来源干细胞作为成体干细胞，操作方法要比胚胎干细胞容易，而且具有较高的成功率，此外，成体干细胞导致肿瘤形成的风险也要低很多，更加可以规避伦理学问题[7、8])。在人与哺乳动物特定组织与器官中，有许多成体干细胞存在，这些细胞是自我更新能力很强，并且具有一定分化潜能的前体细胞，这些细胞成熟并可以分化，成为所属组织的细胞类型。新近的研究表明，成体干细胞属多能干细胞，具有“可塑性”，即可分化生成另一组织的特定细胞，保持向多种组织分化的能力[10]。因此，综上所述，如果能够将胰腺间充质干细胞在体外通过一定的方法使其增殖并定向分化为胰岛细胞，则有望应用于临床，治疗糖尿病。　　目前，尽管细胞培养技术成熟且方法多样，经胰腺间充质干细胞诱导分化所获得的胰岛样细胞，在外形上与朗罕氏胰岛结构相近，但功能上难以达到临床细胞替代治疗的目的。具体表现在[9]：①体外诱导获得的胰岛样结构中，内分泌细胞的所占比例较小，而且细胞连接缺乏;②合成和释放胰岛素的量比正常值低;③在应对葡萄糖的刺激时，缺乏胰岛素的急性分泌反应;④胞浆中分泌胰岛素颗粒缺乏;⑤胰岛样结构分化不彻底，其内尚含有未分化细胞，以及部分分化的细胞。因此目前所应用的培养及诱导分化方案存在着不完善，如何最大程度的模拟体内微环境是一个明确的研究方向。　　最近学界新兴了一种细胞培养方法，即为三维细胞培养(three-dimension cell culture，TDCC)，其特点是应用三维结构载体，与细胞在体外共同培养，这样细胞便能在载体的三维空间中定植生长，最后形成细胞载体复合物，细胞生长环境达到体内环境最大程度的模拟。　　目前三维细胞培养可分为两类，静止性及动力性三维培养，动力性三维培养在更加具有优势，具体表现为[10]：①黏附生长细胞的增殖加快，细胞外基质提供的更丰富，组织再生能力更好;;②细胞植入数量能够达到最大化;③氧气、营养物质向载体内部输送更加充分，细胞活性更加易于保持;④细胞能够沿着孔隙生长，成为三维立体组织;⑤培养液流动过程中，细胞受到机械应力的刺激，细胞功能得以最大程度发挥;⑥CO2可以被更快的排出，生理性pH值得以维持，细胞代谢和功能能够在最有利的微环境中进行。因此，动力性三维细胞培养不仅在生物性微环境和力学刺激方面提供优势，而且细胞功能能够得到最大程度发挥。动力性三维细胞培养相关之聚合三维支架材料及生物灌注反应系统已商品化，可方便购得。　　目的：　　本研究拟利用胰岛分离后的大鼠胰腺组织（含有外分泌细胞和导管细胞）分离胰腺导管上皮细胞，完善胰腺导管细胞分离方法，利用动力性三维细胞培养技术使其增殖并分离，通过鉴定确认为胰腺间充质干细胞，通过持续扩增培养建立起大鼠的胰腺干细胞系，并诱导其向可释放胰岛素的胰岛样细胞团定向分化，探索完善诱导分化所需条件及更合适的体外微环境，确定诱导细胞团的形态、表达特性和功能。本研究以大鼠胰腺作为研究对象，建立大鼠的胰腺间充质干细胞系，采用新兴的动力性三维细胞培养技术，模拟体内微环境，为改进干细胞诱导培养方法提供新的思路。为解决胰岛来源提供新的途径。　　方法：　　原料采用大鼠的胰腺组织，应用0.1％V型胶原酶对大鼠胰腺组织进行原位消化分离，通过不连续密度梯度离心的方法，使得胰岛细胞和胰腺导管细胞初步分离，将胰岛细胞废弃，留取胰腺导管细胞进行培养，在动力性三维细胞培养条件下进行培养，培养结果为获得原代PDSC，并采用含血清培养基进行扩增培养，连续传代，纯化PDSC，完善原代胰腺导管来源干细胞的分离方法、探讨培养条件以及影响因素。鉴定原代分离的PDSC，包括形态学鉴定、表达特性鉴定，以及分化能力鉴定。连续传代，建立胰腺导管来源干细胞系。并对PDSC进行体外诱导分化，使其定向分化为有功能的胰岛样细胞团，并对细胞团进行形态学鉴定以及表达特性等方面的鉴定。　　结果：　　通过原位0.1％V型胶原酶消化，之后进行不连续密度梯度离心，再继以动力性三维培养，可分离培养出大鼠PDSC。形态学方面，PDSC呈单个核。生长行为方面，PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长。通过流式细胞仪分选进行表达特性分析可以得出，CD105、CD73、CD29、CD90在PDSC呈高表达，而CD45、CD14、CD19、CD34呈不表达，由此可以证明PDSC为间充质干细胞。　　在动力性三维细胞培养14天左右，PDSC可以定向分化为胰岛样细胞团(islet-like cell cluster，ICC)。在形态学方面可以观察到ICC表现为细胞融合，成团状聚集，分化后期自培养基脱壁，呈悬浮生长;表达特性方面鉴定采用免疫细胞化学染色，结果提示ICC胰岛素的染色呈现为阳性，提示ICC在蛋白分子水平表达胰岛素;双硫腙(DTZ)染色结果显示，ICC在诱导培养2周时可以被染成红色，由此证明细胞团内含有胰岛素的蛋白分解产物。胰岛素定量测定结果显示，ICC在诱导培养14天时，其细胞外液与细胞的胞浆内均含可以检测得到胰岛素水平，与诱导培养前的PDSC的细胞胞浆内的胰岛素水平做比较，有显著性差异(P＜0.01);但葡萄糖刺激下胰岛素释放试验结果显示，ICC的释放指数SI为1.40，说明ICC的胰岛素释放为非细胞外液葡萄糖浓度依赖性，即ICC仍是未成熟的胰岛素分泌细胞。　　结论：　　1.完善胰腺导管细胞分离方法：采用原位胶原酶消化法，通过不连续密度梯度离心分离，再继以动力性三维细胞培养系统进行细胞培养，可以得到大鼠PDSC，并成功建立PDSC细胞系。　　2.大鼠PDSC是一种表达PDX-1和nestin的MSC。　　3.通过体外动力性三维细胞培养系统，可诱导胰腺PDSC定向分化为有功能的胰岛样细胞团。　　4.大鼠PDSC可在体外大量扩增，并经诱导培养向胰岛素分泌细胞分化，是一种潜在的新的胰岛来源，动力性三维支架培养系统可以作为批量生产PDSC的方法。