子宫内膜癌(EC)是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20％～30％。 1996年起，国外学者开始对儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)与雌激素相关性肿瘤的关系进行研究。报道较多的是COMT基因型与乳腺癌发病的关系，结果不一致。有学者认为，MetMet基因型妇女发生乳癌的危险性高，部分研究认为COMT基因多态主要增加绝经前女性患乳腺癌的风险，也有认为COMT基因多态主要增加绝经后患乳腺癌的风险，还有部分结果是阴性的。 关于COMT基因型与子宫内膜癌或者卵巢癌发生发展关系的研究尚处于开始阶段。2003年Masahia等研究显示子宫内膜癌妇女的MB-COMT基因多启动子区的甲基化明显增加，导致MB-COMT基因失活，从而促进子宫内膜癌的形成。COMT多态性与卵巢癌的关系尚未有定论，大都呈阴性结果。子宫内膜增生过长的形成也与雌激素的持续、单一刺激有关，但至今尚无子宫内膜增生过长与COMT基因型关系的研究报道。 因此，研究与雌激素代谢及相关的代谢酶基因的多态性，对于深入了解EH和EC发生发展的机理、人群易感性的识别及EH和EC的预防和控制都有十分重要的意义。关于COMT多态性与子宫内膜癌以及子宫内膜增生过长发生的关系尚需进一步研究证实。本研究课题拟通过收集我院已病理确诊的子宫内膜癌和子宫内膜增生过长病人的血液和蜡块包埋组织标本，采用PCR-RFLP法分析COMT基因多态性与子宫内膜癌以及子宫内膜增生过长发生风险的关系，从分子遗传学角度探讨儿茶酚-O-甲基转移酶基因多态性对雌激素代谢的影响，及其与子宫内膜癌和子宫内膜增生过长发生的内在联系，为基因干预预防妇科肿瘤的发生提供理论依据及方法。 材料和方法 1.研究对象： ①子宫内膜癌组：我科收治经病理确诊子宫内膜癌患者的120例蜡块和50例全血标本，患者年龄均大于40岁。 ②子宫内膜增殖症组：同期于我院门诊诊刮送病理确诊子宫内膜增殖症，年龄大于40岁患者的120例蜡块标本。 ③对照组：选择同期我科收治、年龄大于40岁的子宫脱垂、子宫颈鳞癌和良性卵巢囊肿患者的子宫内膜蜡块标本100例和血标本19例。临床和病理排除了子宫肌瘤、子宫内膜异位症、子宫内膜增殖症、乳腺癌、宫颈腺癌、卵巢癌。 同时收集子宫内膜癌组和对照组的相关临床资料，包括患者高血压、冠心病、糖尿病病史、吸烟史，初潮时间、末次产年龄、生产次数、绝经年龄，子宫肌瘤、子宫内膜异位症、子宫内膜癌的家族史。全部人员均为我国汉族人，被抽取血标本的患者全部知情同意。 2.实验方法 ①外周血基因组DNA的提取：利用无菌的三蒸水和PBS液提取白细胞后，DNA提取液提取血基因组DNA。 ②蜡块DNA的提取：二甲苯脱蜡，无水乙醇水化后，TE9提取液消化组织，酚一氯仿溶液抽提DNA。 ③引物设计：参照文献设计引物，为使其Tm值更接近，在5’端置换了一个碱基。引物序列为5-TGCTGTGGCTACTCAGCTGTG-3，5-TGAACGTGGTGTGAACACCTG-3。 ④PCR扩增全血基因组DNA片段：反应体系依此加入： 10*PCRbuffer5μldNTPMixture(各2.5mM)4μl上游引物(50mM)1μl下游引物(50mM)1μl模板DNA(0.1-0.5μg)5μlTaq酶0.5μlddH2O33.5μl共50μl，离心约5秒，混匀底物。 参数为：先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，64℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸7min。 ⑤PCR扩增蜡块基因组DNA片段：采用反应体系同上，参数稍不一致，复性温度为67℃，余同上。 ⑥RFLP法检测COMT基因变异：酶切反应，按照说明书操作： PCR产物(237bp)10μl10*NEBBuffer2μl10*BSA0.2μlNiaⅢ酶(5U)0.5μlddH2O7.3μl共20μl，37℃孵育3h。64℃20min灭活，4℃短时保存，-20℃长期保存 20％聚丙酰胺凝胶200V，4℃电泳2h检测酶切产物，SYBRGreenⅠ染色。随机抽取杂合与纯合子样本PCR产物10例交上海博亚广州分公司测序验证。⑦统计方法：采用非条件Logic回归模型分别分析COMT基因型与子宫内膜癌或子宫内膜增生症的关系，后退法筛选出的危险因素作为混杂因素校正。指标用优势比(OR值)和95％置信区间(95％CI)表示。应用χ2检验，分析对照组的COMT基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg定律。Kappa统计量分析PCR-RFLP法和测序方法的一致性。 结果 1.实验概况：所有样本进行DNA抽提和PCR-RFLP实验后，最终可进行分析的有效样本为子宫内膜癌组：蜡块标本82例(68.3％)和全血标本50例，子宫内膜增生过长组：蜡块标本(833％)100例，对照组：蜡块标本91例(91％)和全血标本19例。蜡块标本的总成功率为80.3％，血标本的总成功率为100％。 2.一般情况： ①子宫内膜癌组患者的年龄走势见图3-1，子宫内膜癌组以46-55岁人数最多，为40.2％。子宫内膜癌组绝经前患者55例，绝经后55例，其中≥50岁绝经者占55.3％，≤45岁的占3.9％；对照组绝经前56例，绝经后76例，其中≥50岁绝经者占38.2％，≤45岁的占21.8％；两组比较有统计学差异(p＜0.05)(图3-2)。 图3-1子宫内膜癌组患者的年龄趋势图 图3-2两组患者绝经年龄分布图 ②子宫内膜癌组不孕19例(14.4％)，比对照组高(4.5％)；其高血压病的发生率(19.7％)也高于对照组(9.1％)，差异均有统计学差异(p＜0.05)。两组的糖尿病史、吸烟率比较无统计学差异(p＞0.05)(见表3-2)，两组均没有冠心病和乳腺癌病史。 3.PCR扩增结果：扩增的PCR产物为237bp，并经测序验证，琼脂糖凝胶电泳如图3-3示。 图3-3COMT基因的PCR产物电泳图 4.RFLP法检测DNA变异及其结果的分析：NiaⅢ酶辨认CATG回文序列切割，得到片段为： 基因型酶切片段(bp)COMTVal/Val281145441COMTVal/Met2811496185441COMTMet/Met2896185441酶切图见图3-4。随机抽取10例行DNA测序验证。两种方法一致性比较，Kappa值=0.692，P=0.002，有统计学意义，PCR-RFLP法和测序法的一致性好。图3-4COMT基因扩增产物经Nla酶切后的电泳图；1和3道：COMTVal/Val；2道：COMTMet/Met；4道：COMTVal/Met 5.子宫内膜癌组、子宫内膜增生过长组与对照组COMT基因型的分布频率：COMT各基因型频率在三组中的分布见图3-7。对照组以COMTVal/Val基因型为主(47.3％)，子宫内膜癌组则以COMTVal/Met基因型为主(58.5％)，差异有统计学意义(p＜0.05)。子宫内膜增生过长组与对照组的基因分布比较无统计学差异(p＞0.05)。对照组经Hardy-Weinberg平衡定律检验，χ2值为0.744，P值为0.39，符合H-W遗传平衡规律，数据来自同一蒙德尔群体。 6.COMT多态性与子宫内膜癌发生风险的关系：经Logic回归分析，与COMTMet/Met基因型比较，COMTVal/ValOR值为0.262(p=0.027,95％CI=0.080-0.862)，COMTVal/MetOR值则为0.605(p=0.386,95％CI=0.194-1.883)，显示COMTVal/Val基因型与子宫内膜癌发生风险负相关。 7.COMT基因多态性与子宫内膜增生过长发生风险的关系：与COMTMet/Met基因型比较，COMTVal/ValOR值=0.988(p=0.990,95％CI=0.137-7.116)，COMTVal/MetOR值=0.656(p=0.671，95％CI=0.094-4.582)，未发现COMTVal/Val和COMTVal/Met基因型与子宫内膜增生过长发生风险相关。 结论 1.COMT基因多态性存在种族差异，中国南方汉族人群的COMT基因型以COMTVal/Val最多，COMTVal/Met次之，最少的是COMTMet/Met，高活性基因型明显高于西方人种。 2.携带COMTVal/Val基因型的妇女相对于COMTMet/Met基因型者，其发生子宫内膜癌的风险可能降低。 3.本研究未发现COMT基因多态性与子宫内膜增生过长的发生风险相关。