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金黄色葡萄球菌(以下简称,金葡菌)奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织受到金葡菌感染而引起的炎症反应。长期的抗生素治疗不仅加剧了致病菌的抗药性,同时增大了药物残留所带来的隐患。培育抗金葡菌奶牛乳房炎新品系成为了解决这一问题的期望手段。MicroRNAs(以下简称miRNAs)可通过遏制其靶基因的翻译或导致靶基因降解而发挥调控功能。因此,本研究旨在挖掘金葡菌乳房炎抗性相关miRNAs,并对其靶基因参与金葡菌奶牛乳房炎发生的调控机制进行研究,以期为金葡菌奶牛乳房炎的早期诊断及抗性分子标记辅助选择的鉴定奠定基础,为揭示乳腺组织炎症反应发生的抗性机制研究提供依据。本研究首先通过体细胞计数、病原菌鉴定、奶样PCR以及组织切片观察等方法鉴定健康牛及金葡菌乳房炎患病牛,并利用高通量测序技术构建乳腺组织miRNAs差异表达谱。经生物信息学分析,对差异表达miRNAs进行靶基因预测及功能注释分析,获得金葡菌乳房炎抗性相关miRNAs,并利用RT-qPCR对其进行鉴定。进而,利用生物信息学技术预测金葡菌乳房炎抗性相关miRNA的候选靶基因,并利用细胞培养、miRNA转染、RT-qPCR、Western Blot、种子区定点突变以及双荧光素酶报告基因检测技术对该靶向关系进行鉴定。同时,使用金葡菌源脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,以下简称LTA)诱导Mac-T细胞炎症反应,利用细胞培养、miRNA转染、RT-qPCR技术构建金葡菌乳房炎细胞模型并探究金葡菌乳房炎抗性相关miRNA对金葡菌乳腺炎症反应发生的影响;利用细胞培养、DNA转染、RT-qPCR、Western Blot技术构建靶基因干扰及过表达细胞模型进而检测分析金葡菌乳房炎抗性相关miRNA靶基因参与的炎症反应相关信号通路关键蛋白的表达变化。使用金葡菌感染产后雌性BALB/c小鼠的乳腺组织,利用RT-qPCR、组织切片制作以及Western Blot技术,分析小鼠乳腺炎性细胞因子mRNA表达水平变化、小鼠乳腺组织形态结构变化以及金葡菌乳房炎抗性相关miRNA靶基因参与的炎症反应相关信号通路关键蛋白的表达变化。结果表明,在8头候选奶牛中,1号、4号和8号牛鉴定为健康牛,2号、6号和7号牛为金葡菌乳房炎患病牛。与健康牛相比,在金葡菌乳房炎患病牛乳腺组织中,29个差异表达miRNAs显著上调,19个差异表达miRNAs显著下调。差异表达miRNAs的候选靶基因的功能注释分析表明,bta-miR-223、bta-miR-205、bta-miR-21-5p等参与多条炎症反应相关信号通路,可作为金葡菌奶牛乳房炎抗性调控关键因子的候选分子标记辅助选择。将30 pmol/mL bta-miR-223 mimic及bta-miR-223 inhibitor转染至Mac-T细胞48 h,可分别成功构建bta-miR-223过表达及干扰细胞模型。用40μg/mL LTA诱导Mac-T细胞24 h,可成功构建炎症细胞模型。Bta-miR-223过表达及干扰细胞模型和LTA诱导的炎症细胞模型联合使用,发现bta-miR-223的高表达可使细胞抵抗金葡菌源LTA诱导的炎症反应。与对照组相比,在bta-miR-223过表达的Mac-T细胞中,Cbl原癌基因B(Casitas B lymphoma-b,以下简称CBLB)的mRNA和蛋白表达水平极显著下调,当bta-miR-223干扰后,CBLB的表达变化呈现相反趋势。CBLB-3’-UTR原始荧光素酶载体与bta-miR-223 mimic共转染后,细胞的相对双荧光素酶活性急剧下降,而CBLB-3’-UTR突变荧光素酶载体与bta-miR-223 mimic共转染后,细胞相对双荧光素酶活性无明显变化,证明CBLB是bta-miR-223的直接调控靶标。将4μg/mL的CBLB过表达及干扰载体转染至Mac-T细胞72 h,可成功构建CBLB过表达及干扰细胞模型。CBLB过表达及干扰细胞模型和LTA诱导的细胞炎症模型进行联合使用,发现在CBLB过表达以及LTA刺激后的Mac-T细胞中,PI3K蛋白、AKT蛋白表以及NF-κB p65蛋白磷酸化水平极显著上调,而在CBLB干扰以及LTA刺激后的Mac-T细胞中,PI3K蛋白表达量下调,AKT蛋白表达量显著下调,NF-κB p65蛋白磷酸化水平极显著下调,说明bta-miR-223通过直接靶向CBLB经PI3K/AKT/NF-κB途径参与金葡菌乳房炎抗性调控。使用10~8CFU/100μL金葡菌感染BALB/c小鼠乳房48 h,可成功构建金葡菌小鼠乳房炎模型。与PBS对照组相比,金葡菌感染组小鼠乳腺CBLB蛋白、PI3K蛋白、AKT蛋白以及NF-κB p65蛋白磷酸化水平极显著上调。本研究成功构建健康牛与金葡菌乳房炎奶牛乳腺组织miRNAs表达谱,并经鉴定获得48个两文库中差异表达miRNAs;差异表达miRNAs候选靶基因功能预测与分析表明,bta-miR-223、bta-miR-205和bta-miR-21-5p等,可作为金葡菌奶牛乳房炎候选分子标记辅助选择;bta-miR-223潜在抗性调控机制研究表明,其可通过直接靶向CBLB,下调PI3K蛋白、AKT蛋白及NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,从而缓解LTA诱导的Mac-T细胞炎症反应。