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基因组编辑技术能够通过在基因组中进行靶向特异性的突变,从而为了解基因功能和开展基因治疗等提供技术支持。基因组编辑(genome editing,GE)技术利用构建的人工内切酶,在基因组靶位点对双链进行切割,产生的DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)能够被细胞内的DNA修复系统在修复过程中产生突变,从而达到定点改造基因组的目的。该技术对破译基因功能和开展基因治疗等是一种有力的工具,建立能够快速、准确检测DSBs的技术则显得尤为重要。本研究建立了一种方便快捷地检测DNA的DSBs引起的基因重组的方法。对DSBs进行检测是研究GE产生及其效率的关键。传统的检测DSBs的方法主要有γ-H2AX检测方法和荧光报告基因检测。γ-H2AX作为DNA的损伤标记,通过检测γ-H2AX,进而检测DNA双链断裂。但是,该方法较为复杂,操作比较繁琐。甚至有部分细胞活动并不导致DSBs的产生,仍然有可能产生γ-H2AX。而荧光报告基因检测方法是通过构建突变的荧光蛋白载体来实现的。但是该方法只能检测到使荧光蛋白基因恢复读码框的突变,且主要在转基因植物中进行,操作并不简便。总之,传统的检测DSBs的方法较为复杂、繁琐。因此,构建简单、快速的此类检测技术是非常必要的。本研究包括:(1)构建了正向重复片段的GUS基因载体,利用其重组并恢复表达以检测DSBs;(2)建立了由引导RNA和噬菌体MS2外壳蛋白偶联限制性核酸内切酶(guided RNA and tethered endonuclease,GRATEN)的基因组编辑系统,在GUS基因内部DNA重复区切割,导致DSBs,DSBs经同源序列引导修复(homology-directed repair,HDR)途径,引起GUS基因重组,恢复其功能。我们在烟草叶片中进行瞬时表达的操作,从而完成对DSBs的检测。借助正向重复片段的GUS显色,更加便于观察。整个系统的特点是设计简单,对打靶序列没有特异性的要求,建立一种简单、精确和高效的新型植物基因组编辑技术体系。此方法可以经过GUS染色后快速、直观地检测位点特异的DSBs。通过GUS与其底物的反应,以达到半定量、直观快速检测DSBs的目的。目前常用的GE技术有:(1)人工介导的锌指核酸酶技术(zinc finger nuclease,ZFN);(2)转录激活因子类效应子核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases,TALEN);(3)由RNA介导的成簇规律性间隔的短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统。这三种技术都是通过对DNA双链的特定位点进行识别,从而切割造成DSBs。但是,ZFN、TALEN或是CRISPR系统在实际应用中都存在缺陷,即都可在非目标位点进行打靶,从而造成脱靶现象。我们利用GRATEN系统对GUS基因进行定点突变,结果表明可产生GUS基因内部较大DNA片段的缺失,说明该技术在基因组编辑中是切实可行的。